2. 中国医学科学院 药物研究所，北京 100050
2. Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100050, China
糖尿病肾病(DN)是1型糖尿病(DM)和2型DM的严重并发症之一，如缺乏有效治疗会导致终末期肾病的发生，消耗大量的医疗资源并危及病人的生命。DN的典型特征包括肾小球滤过率增高、蛋白尿、细胞外基质(ECM)沉积、肾小球纤维化和硬化等[1]。DN的具体发病机制目前还不十分清楚，大量研究表明机体内的高葡萄糖水平在此过程中发挥重要作用[1-4]。
天然产物小檗碱(BBR)是一种植物来源的异喹啉类生物碱，大量研究表明[5]，其具有多种药理学活性并具有良好的降血糖作用。而且临床研究和动物实验均证实BBR对于控制DN有效[6-8]。如有报道BBR用于临床可降低DN患者的24 h尿蛋白水平[6]；在动物实验中，BBR可降低链脲佐菌素(STZ)诱导的DM大鼠的24 h尿蛋白、血尿素氮(BUN)、血清肌酐(Scr)，并改善肾脏病理学变化[7-8]。
假BBR(Y53)是BBR的同分异构体[9]。与BBR比较，其具有改进的药代动力学特点和更强的降血糖、降血脂作用[9-10]。我们之前的研究结果证明Y53在STZ和高脂饲料诱导的DM合并脂肪肝的小鼠模型中具有明显的改善氧化应激和炎症反应的作用[11]。但该化合物对DN的作用没有报道，在本研究中，我们以Y53来治疗STZ诱导的DM小鼠，发现其具有明显的保护肾脏和缓解DN进展的作用。
1 材料与方法 1.1 药品与试剂Y53由本所化学室合成[9]，BBR、STZ、柠檬酸和柠檬酸钠购自美国Sigma-Aldrich公司，罗格列酮(ROSI)购自江苏恒瑞医药股份有限公司。总一氧化氮(NO)测定试剂盒购自上海碧云天生物技术研究所。血清BUN、Scr检测试剂盒购自南京生物工程研究所。SV总RNA纯化系统、GoScriptTM反转录系统和GoTaq® qPCR Master Mix均购自美国Promega公司。糖化血红蛋白(GHb)检测试剂盒(酶法)和尿总蛋白测定试剂盒(焦酚红法)购自北京九强生物技术股份有限公司。晚期糖基化终末产物(AGEs)酶联免疫吸附实验(ELISA)检测试剂盒购自美国Cell Biolabs公司。罗氏活力型血糖试纸和血糖仪购自美国罗氏公司。组织胆固醇(CHO)酶法测定试剂盒和组织三酰甘油(TG)酶法测定试剂盒均购自北京普利莱基因技术有限公司。M-PER® Mammalian蛋白裂解液、Halt®蛋白酶&磷酸酶双重抑制剂、BCA蛋白浓度测定试剂盒购自美国Thermo Scientific公司。转化生长因子-β1(TGF-β1)、Smad2、纤维连接蛋白(FN)、Ⅳ型胶原蛋白(Collagen Ⅳ)和β-肌动蛋白(ACTB)的单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司。PVDF膜购自美国Millipore公司。
1.2 实验动物SPF级C57BL/6J小鼠[♂，体质量(21.0 ±1.50) g]购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证编号：SCXK(京)2007-0001。小鼠于本所实验动物房饲养笼中饲养，每笼1只。投喂啮齿类动物常规饲料，自由饮水，室温20℃~24℃，12 h明暗循环。
1.3 方法 1.3.1 动物实验动物实验方案由本所伦理委员会审核并批准。
小鼠适应性喂养5 d后禁食过夜，一次性腹腔注射STZ 120 mg·kg-1用于诱发1型DM[11]，部分小鼠腹腔注射等体积柠檬酸钠缓冲液作为正常对照组(n=10)。STZ注射72 h后禁食过夜，剪尾尖取血，使用血糖仪检测小鼠空腹血糖(FBG)，以FBG≥11.1 mmol·L-1为造模成功。
将造模成功的小鼠随机分为4组，分别为DM对照组、DM+BBR(50 mg·kg-1)组、DM+Y53(50 mg·kg-1)组和DM+ROSI(5 mg·kg-1)组，每组12只。每日下午3个治疗组动物分别口服灌胃给予BBR、Y53和ROSI，正常对照组和DM对照组动物给予等体积生理盐水，隔天称取并记录动物体重和摄食量。
给药4周后，全部动物禁食过夜，摘眼球法取血。测定FBG，取部分全血置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝处理后的离心管，4℃保存用于GHb的检测；分离余下全血的血清用于检测BUN、Scr水平并留取部分血清待用于后续实验。
断颈处死动物后，取肾脏并称重，以双肾重量/体重×100定义为肾指数。一侧肾脏用10%多聚甲醛固定用于苏木精-伊红(HE)染色，余下的肾组织迅速放入液氮中冷冻用于后续实验。
1.3.2 病理学检验肾组织石蜡包埋，切片(厚度为4 μm)之后HE染色。病理切片在光学显微镜下观察并拍照，将肾组织的病变按照病理学改变程度进行分级(0~4，0为最轻，4为最重)。
1.3.3 GHb、NO、AGEs和尿蛋白测定参照试剂盒说明书以酶法测定血液中GHb浓度，以EnSpire®Multimode Plate Reader多功能酶标仪(美国PerkinElmer公司)读取700 nm吸光度值，结果以百分数(%)表示。
肾组织以4℃磷酸缓冲盐溶液(PBS)匀浆，2 000 r·min-1离心10 min，取上清液。血清及肾组织中的NO利用试剂盒以Griess Reagent法测定，按照说明书操作；肾组织中NO的浓度以蛋白含量为基准进行校正。
血清及肾组织中的AGEs浓度利用试剂盒以ELISA法测定，按照说明书操作；肾组织中AGEs的浓度以蛋白含量为基准进行校正。
注射STZ之前以及实验结束前1 d，以代谢笼收集动物24 h尿标本，记录尿量。利用试剂盒以焦酚红法测定尿蛋白浓度，按照如下公式计算出每只动物的24 h尿蛋白总量：24 h尿蛋白总量/mg=样品尿蛋白浓度(mg·mL-1)×尿量(mL)。
1.3.4 总RNA提取和实时荧光定量反转录-PCR(qRT-PCR)使用SV总RNA纯化系统按照说明书提取小鼠肾组织总RNA，参照我们之前的报道[11]对样品进行反转录并以基因特异性引物(Tab 1)进行扩增。以ACTB基因的表达量为内参进行校正后，以比较循环阈值(CT)的方法对靶基因mRNA的表达水平进行相对定量，结果以正常对照组的倍数表示。
| Gene | Forward primer | Reverse primer |
| TGF-β1 | TGGAGCAACATGTGGAACTC | GTCAGCAGCCGGTTACCA |
| Smad2 | AGGACGGTTAGATGAGCTTGAG | GTCCCCAAATTTCAGAGCAA |
| FN | CATCAGCCCGGATGTCAGAA | GGCATTGTCGTTGAGCGTGTA |
| Collagen Ⅳ | CCTGGCACAAAAGGGACGA | ACGTGGCCGAGAATTTCACC |
| ACTB | GGATGCAGAAGGAGATTACTGC | CCACCGATCCACACAGAGTA |
肾组织匀浆后，按照试剂盒说明书提取总蛋白；蛋白定量后，使用含50 μg蛋白的样品以8%分离胶进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并进行Western blot实验，具体步骤参考我们以前的报道[10]。靶蛋白的表达水平以ACTB为内参校正后以正常对照组动物的倍数表示。
1.3.6 肾组织CHO及TG含量测定肾组织匀浆后，按照试剂盒说明书测定其中CHO和TG的浓 度；肾脏中CHO和TG的含量以称取的组织重量进行校正[11]。
1.4 统计分析实验数据以各组动物的x±s表示，以SPSS13.0软件对数据进行处理和分析。组间比较采用方差分析，两两比较采用Newman-Keuls检验。
2 结果 2.1 Y53明显改善小鼠的DM症状如Tab 2所示，腹腔注射STZ前，各组动物的基础FBG水平几乎一致。而在腹腔注射STZ后动物出现明显的DM症状如高血糖(Tab 2)、多尿(Tab 3)、多食和体重减轻(Tab 4)。
| Normal control(n=10) | DM control(n=12) | DM+BBR 50(n=12) | DM+Y53-50(n=12) | DM+ROSI5(n=12) | |
| FBG/mmol·L-1 | |||||
| Before STZ | 7.19±0.59 | 6.89±0.65 | 7.16±0.71 | 7.22±0.58 | 7.04±0.67 |
| After STZ | 6.87±0.55 | 21.0±3.45** | 20.2±3.67** | 21.3±3.21** | 21.5±3.89** |
| After experiment | 7.05±0.62 | 22.0±2.98** | 17.5±2.21# | 13.6±1.56##△ | 17.1±1.97# |
| GHb/% | 3.57±0.41 | 7.71±0.91** | 5.95±0.67# | 4.23±0.48##△ | 5.87±0.71# |
| BUN/mmol·L-1 | 6.69±0.61 | 12.4±1.56** | 9.53±1.12# | 7.24±0.89##△ | 9.45±1.04# |
| Scr/μmol·L-1 | 164±14.6 | 459±61.2** | 353±46.3# | 265±32.6##△ | 340±40.9# |
| AGEs/ng·L-1 | 81.3±7.88 | 150±17.7** | 118±13.2# | 87.8±9.67##△ | 115±13.3# |
| NO/μmol·L-1 | 34.6±4.56 | 67.5±8.65** | 53.7±6.78# | 39.8±5.14##△ | 53.0±7.56# |
| **P<0.01 vs normal control;#P<0.05,##P<0.01 vs DM control;△P<0.05 vs DM+BBR 50 or DM+ROSI 5. | |||||
| Normal control(n=10) | DM control(n=12) | DM+BBR50(n=12) | DM+Y53-50(n=12) | DM+ROSI5(n=12) | |
| 24 h urine amount/ml·mouse-1 | |||||
| Before STZ | 2.33±0.28 | 2.42±0.31 | 2.16±0.26 | 2.38±0.32 | 2.24±0.25 |
| After experiment | 2.61±0.19 | 14.7±1.89** | 10.9±1.32# | 8.26±1.00##△ | 10.5±1.45# |
| 24 h urinary protein/mg·mouse-1 | |||||
| Before STZ | 0.43±0.06 | 0.45±0.07 | 0.39±0.05 | 0.44±0.06 | 0.41±0.06 |
| After experiment | 0.46±0.07 | 2.88±0.37** | 2.19±0.29# | 1.58±0.19##△ | 2.13±0.25# |
| AGEs/μg·g-1 protein | 185±21.8 | 306±40.2** | 246±26.7# | 202±23.3##△ | 241±27.6# |
| NO/μmol·g-1 protein | 2.57±0.39 | 4.66±0.51** | 3.57±0.45# | 2.89±0.36##△ | 3.53±0.43# |
| CHO/μmol·g-1 kidney | 11.2±1.45 | 19.9±2.07** | 15.3±1.87# | 11.7±1.34##△ | 14.9±1.61# |
| TG/μmol·g-1 kidney | 6.84±0.87 | 11.6±1.56** | 9.51±1.08# | 7.35±0.87##△ | 9.43±0.99# |
| **P<0.01 vs normal control;#P<0.05,##P<0.01 vs DM control;△P<0.05 vs DM+BBR50 or DM+ROSI5 | |||||
| Normal control(n=10) | DM control(n=12) | DM+BBR50(n=12) | DM+Y53-50(n=12) | DM+ROSI5(n=12) | |
| Food intake/g·day-1 | |||||
| Before STZ | 3.37±0.29 | 3.61±0.31 | 3.58±0.33 | 3.49±0.34 | 3.28±0.28 |
| After experiment | 3.42±0.36 | 5.81±0.71** | 4.61±0.56# | 3.62±0.46##△ | 4.57±0.61# |
| Body weight/g | |||||
| Before STZ | 23.7±1.98 | 23.1±1.67 | 23.9±1.59 | 23.1±1.81 | 23.6±1.79 |
| After experiment | 25.7±2.89 | 19.4±2.02* | 19.9±1.87* | 19.6±2.04* | 19.7±1.88* |
| Kidney weight/g | 0.31±0.02 | 0.32±0.04 | 0.29±0.04 | 0.24±0.03#△ | 0.29±0.04 |
| Kidney index/% | 1.21±0.09 | 1.65±0.19* | 1.46±0.17 | 1.22±0.15#△ | 1.47±0.17 |
| *P<0.05,**P<0.01 vs normal control;#P<0.05,##P<0.01 vs DM control;△P<0.05 vs DM+BBR50 or DM+ROSI5 | |||||
注射STZ后，与正常对照组比较，DM组动物的FBG增至3.06倍(P<0.01，Tab 2)。DM组与各给药组在给药前的FBG水平差异无统计学意义。每天灌胃给予50 mg·kg-1的BBR 4周后小鼠的FBG平均下降20.5%(与DM对照组比较P<0.05)，其降糖药效接近于5 mg·kg-1的ROSI(Tab 2)。实验结束时DM对照组动物的GHb是正常对照组的2.16倍(P<0.01)，BBR和ROSI使GHb水平分别平均下降约22.8%和23.9%(与DM对照组比较P<0.05)。与BBR和ROSI相比，Y53显示了更强的降糖效能，50 mg·kg-1的Y53给药4周能分别降低DM小鼠的FBG和GHb平均约38.2%和45.1%(与DM对照组比较P<0.01)，明显优于BBR和ROSI(P<0.05)。
从Tab 2中还能看出，DM对照组小鼠血清中AGEs和NO水平均明显升高(与正常对照组比较P<0.01)。BBR和ROSI可部分降低血清AGEs和NO(与DM对照组比较P<0.05)；Y53的药效明显强于BBR和ROSI(P<0.05)。
各组动物的摄食量和体重在STZ注射前基本相同(Tab 4)。在造模之后与正常对照组动物比较，DM对照组动物每天多摄入约69.9%的食物(P<0.01)，而体重下降约24.5%(P<0.05)。BBR、ROSI和Y53都不能影响DM小鼠的体重，但能够改善其多食症状。其中Y53给药后可使DM小鼠的摄食量减少约37.7%(与DM对照组比较，P<0.01)，其效果明显强于BBR和ROSI(P<0.05)。
2.2 Y53明显改善DM小鼠的肾脏损伤如Tab 2和Tab 3所示，与正常对照组小鼠相比，DM对照组小鼠的24 h尿量增至5.63倍(P<0.01)，并且其肾功能发生了严重损伤，表现为血清BNU、Scr和24 h尿蛋白量分别增至1.85倍(P<0.01)、2.80倍(P<0.01)和6.26倍(P<0.01)。给药4周后，BBR和ROSI可部分降低DM小鼠的24 h尿量，并使肾功能得到部分恢复(P<0.05)。而50 mg·kg-1的Y53给药4周可分别降低24 h尿量、血清BUN、Scr和24 h尿蛋白量平均达43.8%、41.6%、42.3%和45.1%(与DM对照组比较P<0.01)，效果比BBR和ROSI更明显(P<0.05)。另外DM对照组小鼠的肾指数明显升高(与正常对照组比较P<0.05，Tab 4)，BBR和ROSI对肾脏重量和指数没有明显影响，而Y53却能明显降低DM小鼠的肾脏重量并恢复肾指数至接近正常(与DM对照组、DM+BBR 50组和DM+ROSI 5组比较P<0.05)。
病理学结果(Fig 1)显示，正常对照组小鼠的肾脏形态和结构正常。而DM对照组小鼠已出现严重的肾损伤：镜下可见肾组织的结构被严重破坏、肾小球囊腔狭窄、肾小球系膜弥漫性增厚伴ECM沉积、肾小球硬化和炎症细胞浸润(与正常对照组比较P<0.01)。DM小鼠的肾脏病理改变可被BBR和ROSI部分缓解，而50 mg·kg-1的Y53给药4周后能够极明显地改善DM小鼠肾组织的病理学改变，抑制肾小球系膜扩张和肾小球硬化，减少肾组织中炎症细胞的浸润(与DM对照组比较P<0.01)，其效果明显强于BBR和ROSI(P<0.01)。
|
| 图 1 Effects of studying compounds on renal pathological changes(HE staining,×400,scale bar=50 μm)(A) and scores(x±s,n=10~12)(B) **P<0.01 vs normal control group;##P<0.01 vs DM control group;△△P<0.01 vs DM+BBR50 or DM+ROSI5 group |
DM对照组小鼠肾组织中TGF-β1和Smad2的mRNA(Fig 2A)和蛋白(Fig 2B)水平与正常对照组相比均明显升高(P<0.01或P<0.01)。BBR、ROSI和Y53都能下调他们的表达，其中Y53的效果强于BBR和ROSI(P<0.05)。另外，STZ诱导上调的ECM组成成分如FN和Collagen Ⅳ的 mRNA(Fig 2A)和蛋白(Fig 2B)的表达水平也被50 mg·kg-1的Y53明显抑制(与DM对照组比较P<0.01，与DM+BBR 50和DM+ROSI 5组比较P<0.05)。
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| 图 2 Effects of studying compounds on renal mRNA(A) and protein(B) expression levels of target genes(x±s,n=10~12) **P<0.01 vs normal control group;#P<0.05,##P<0.01 vs DM control group;△P<0.05 vs DM+BBR50 or DM+ROSI5 group |
与血清的检测结果相一致，DM对照组小鼠肾组织中的AGEs和NO水平与正常对照组比较明显升高(P<0.01,Tab 3)。BBR和ROSI可部分降低肾组织中的AGEs和NO；而Y53的作用更强，可将这些指标降至接近正常(与DM+BBR 50和DM+ROSI 5组比较P<0.05)。
另外，DM对照组小鼠肾组织中的CHO和TG含量(Tab 3)较正常对照组动物明显升高(P<0.01)，Y53可分别降低这两项指标平均达41.2%和36.6%(与DM对照组比较P<0.01)，其效果明显优于BBR和ROSI(P<0.05)。
3 讨论本研究中，我们首次报道BBR类似物Y53对于缓解STZ诱导的C57BL/6J小鼠的肾脏损伤有较强的活性。Y53改善DN的具体分子机理尚不明确。研究表明BBR可通过调控多条细胞信号通路如AMP依赖的蛋白激酶(AMPK)来发挥肾脏保护的药效[12-13]。根据BBR抗DN机制的线索，有必要对Y53在体内对AMPK等通路的影响进行深入研究并与BBR进行比较。
我们观察到Y53恢复DM动物肾功能、减少肾脏脂质沉积的效果明显优于同等剂量的BBR。这可能是因为口服给药后Y53具有更好的药代动力学参数[10]。在后续工作中，我们将研究Y53在肾脏、肝脏、肌肉等不同器官和组织中的分布来进一步阐明其药代动力学特征。
TGF-β1及其下游分子Smad2在DN的发生和发展中发挥关键作用[1,3]。DM状态下的高血糖可明显上调TGF-β1和Smad2的表达，进而促进ECM沉积和肾小球纤维化[1,3]。本文的结果显示Y53可明显下调TGF-β1、 Smad2、FN和Collagen Ⅳ的表达并抑制肾小球硬化。肾组织中TGF-β1的表达增加与蛋白激酶C(PKC)的活化有关[1]，Y53对肾脏中PKC通路的影响值得深入研究。
AGEs可通过结合于AGEs受体(RAGE)来促进DN的发生[4,14]。目前，AGEs-RAGE系统被认为是治疗包括DN在内的DM并发症的一个有效的药物靶点[4,14]。我们的结果证实Y53在DM小鼠体内能够明显降低血清和肾组织中AGEs的含量，这可能成为其将来应用于临床治疗DN的一个优势所在。但Y53对RAGE的影响还不清楚，需要深入研究。
目前看来，NO在DM机体内的水平存在着一个动态变化的过程，且与DN的发生和发展密切相关。如有报道在STZ诱导的大鼠体内，DM发病后2~4周时血清和肾脏内NO的水平明显增加[15-16]，并且肾脏内NO水平的升高可能反映了肾小球的高滤状态[16]。在此之后，NO水平则逐渐下降，直至在第8周时明显低于正常动物的水平[15-16]。我们的研究结果支持了上述发现，且在我们的实验中，Y53和BBR可明显降低血清和肾脏中的NO水平。但也有报道称BBR能够通过上调内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的表达来增加心肌细胞中NO的含量，并认为该作用与BBR对心肌细胞的保护功能有关[17]。以上这些结果说明BBR在不同的组织中和疾病的不同阶段对NO的影响是不同的。Y53对NO的影响是否也具有组织和时间特异性还需要进一步研究。
综上所述，本研究发现天然产物BBR的类似物Y53在STZ诱导的DM小鼠体内具有明显的缓解肾脏损伤、恢复肾脏形态和功能的作用。结合我们之前的研究[10-11]，Y53在未来可开发用于治疗DM及其并发症如DN。
( 致谢: 本文实验在中国医学科学院医药生物技术研究所病毒室和化学室完成，感谢左增艳副主任技师在动物实验中给予的技术帮助。 )
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