四川动物  2018, Vol. 37 Issue (3): 268-273

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陈熙, 王斌, 罗旭
CHEN Xi, WANG Bin, LUO Xu
白腹鹭COⅠ和Cyt b基因序列分析及鹭属系统发育研究
Gene Sequences of COⅠ and Cyt b of Ardea insignis and Molecular Phylogenetic Analysis of Genus Ardea
四川动物, 2018, 37(3): 268-273
Sichuan Journal of Zoology, 2018, 37(3): 268-273
10.11984/j.issn.1000-7083.20170353

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收稿日期: 2017-11-10
接受日期: 2018-03-13
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陈熙, 王斌, 罗旭. 白腹鹭COⅠ和Cyt b基因序列分析及鹭属系统发育研究[J]. 四川动物, 2018, 37(3): 268-273.
CHEN Xi, WANG Bin, LUO Xu. Gene Sequences of COⅠ and Cyt b of Ardea insignis and Molecular Phylogenetic Analysis of Genus Ardea[J]. Sichuan Journal of Zoology, 2018, 37(3): 268-273.
白腹鹭COⅠ和Cyt b基因序列分析及鹭属系统发育研究
陈熙1 , 王斌2 , 罗旭1*     
1. 西南林业大学, 西南地区生物多样性保育国家林业局重点实验室, 昆明 650224；
2. 云南高黎贡山国家级自然保护区泸水管护分局, 云南泸水 673100
收稿日期: 2017-11-10; 接受日期: 2018-03-13
基金项目: 环保部生物多样性示范观测项目（2016-2017）；云南省极小种群物种拯救保护项目（2016）
作者简介: 陈熙(1993-), 女, 硕士研究生, 研究方向:野生动植物保护与利用, E-mail:18387158232@163.com.
*通信作者 Corresponding author, 罗旭, 副教授, 研究方向:鸟类进化、生态与保护, E-mail:xu_luo@aliyun.com.
摘要：白腹鹭Ardea insignis数量稀少，被世界自然保护联盟列为极危（CR）物种，关于该物种的生态信息和分子生物学研究极少。本研究通过扩增得到了白腹鹭的2个线粒体基因序列（COⅠ和Cyt b），Cyt b基因序列长度为1 163 bp，其中的A+T含量（51.7%）高于C+G（48.3%），第三位点上碱基偏倚最突出；COⅠ基因序列长度为722 bp，A+T含量（52.5%）高于C+G（47.5%），碱基偏倚同样在第三位点最明显。结合来自GenBank鹭属Ardea其他6个物种的COⅠ和Cyt b基因序列，构建鹭属的系统发育树，结果表明，鹭属7种鸟类构成单系，后验概率支持度为96%，大白鹭A. alba和白腹鹭在鹭属中是较早分化出的类群，位于鹭属分支的基部；白腹鹭与草鹭A. purpurea的遗传距离最近。
关键词：白腹鹭     COⅠ基因     Cyt b基因     系统发育树    
Gene Sequences of COⅠ and Cyt b of Ardea insignis and Molecular Phylogenetic Analysis of Genus Ardea
CHEN Xi1 , WANG Bin2 , LUO Xu1*     
1. State Forestry Administration Key Laboratory of Biodiversity Conservation in Southwest China, Southwest Forestry University, Kunming 650224, China;
2. Lushui Management Bureau of Gaoligongshan National Nature Reserve, Lushui, Yunnan Province 673100, China
Abstract: Ardea insignis is a rare species and listed as a critically endangered species in the IUCN red list of threatened species. It belongs to genus Ardea of family Ardeidae. There are very few studies carried on this species. We obtained COⅠ and Cyt b gene sequences of A. insignis using PCR technology. The length of the Cyt b gene was 1 163 bp, and the A+T content (51.7%) was higher than that of C+G (48.3%). The length of the COⅠ gene was 722 bp, and the A+T content (52.5%) was also higher than that of C+G (47.5%). The third site of both genes showed the most remarkable base bias. Combined with the sequences of the other 6 Ardea species from GenBank, the phylogenetic tree of genus Ardea was constructed. The result showed that 7 species of genus Ardea formed a monophyletic clade with the posterior support at 96%. A. alba and A. insignis were found at the basal position of this clade, indicating their early diverge. Based on the genetic analysis, A. purpurea was considered to be the most closely related species to A. insignis.
Keywords: Ardea insignis     COⅠ gene     Cyt b gene     phylogenetic tree    

白腹鹭Ardea insignis隶属于鹭科Ardeidae鹭属Ardea(Gill & Donsker, 2014), 是一种体型较大的涉禽, 高达127 cm, 整体呈灰色, 分布于尼泊尔、不丹、印度东北部和缅甸北部, 我国云南西部(Hoyo et al., 1992；韩联宪等, 2015)。自1994年, 白腹鹭被世界自然保护联盟(IUCN)列为濒危(EN)物种, 后升级为极危(CR)物种, 全球数量不足500只(IUCN, 2016)。在《中国脊椎动物红色名录》中, 白腹鹭的现状是缺乏数据(DD)(蒋志刚等, 2016)。对于该物种, 不论是野外分布、种群现状, 还是系统分类、分子生物学研究, 均近于空白。

关于鹭类的系统分类研究历来不多, 或者分类取样十分有限(张保卫等, 2002；常青等, 2003；张国萍等, 2005)。鹭属内的物种归属也一直存在争议。比如, 大白鹭A. alba和中白鹭A. intermedia长期以来被置于白鹭属Egretta(郑作新, 1964, 1994；Hermann et al., 1972；Ben et al., 1975), 但Sibley和Monoroe(1990)根据DNA杂交研究结果, 将大白鹭归入大白鹭属Casmerodius, 中白鹭则独立成中白鹭属Mesophoyx。但在国际鸟类联合会(International Ornithologists Committee, IOC)的鸟类名录和目前国内普遍采用的鸟类分类系统中, 大白鹭和中白鹭都置于鹭属(郑光美, 2017)。对于白腹鹭, 由于缺乏研究, 中国鸟类分类系统一直沿用Peters的分类方式, 将其置于鹭属(Peters, 1945；郑作新, 1964；郑光美, 2017), 但尚无分子系统学的验证。

本研究根据IOC的分类系统, 对鹭属鸟类进行系统发育分析。分子标记采用线粒体DNA中的细胞色素b(cytochrome b, Cyt b)基因和细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(cytochrome oxidase subunit Ⅰ, COⅠ)基因, 它们都被广泛运用于鸟类分类与系统发育关系的研究(Mindell, 1997；Weibel & Moore, 2002；Hebert et al., 2004；Webb & Moore, 2005)。选择鹭属内7种作为内群, 选择鹭科中与鹭属亲缘关系近且有相应基因序列信息的其他6属7种作为外群, 构建系统发育树。

1 材料和方法 1.1 材料

2014年, 在云南泸水发现的1只白腹鹭是该物种在中国分布的第一条确切记录(韩联宪等, 2015)。该个体于云南野生动物园进行救助, 饲养过程中死亡, 我们获得少量实验样品。其余物种的Cyt b和CO Ⅰ 基因序列均来自美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)(表 1)。

表 1 鹭科14种鸟类基因序列信息 Table 1 List and gene information of 14 Ardeidae species
属Genus 物种Species 登录号
Cyt b基因 CO Ⅰ基因
鹭属Ardea 草鹭A. purpurea KJ941160 AB842574
大白鹭A. alba GU346975 AB842563
大蓝鹭A. herodias KX534434 DQ432748
白腹鹭A. insignis 本研究 本研究
黑冠白颈鹭A. cocoi — KM896243
苍鹭A. cinerea AY567914 GU571740
中白鹭A. intermedia FJ499022 HM804921
啸鹭属Syrigma 啸鹭S. sibilatrix AF193820 FJ028369
美洲夜鹭属Nyctanassa 黄冠夜鹭N. violacea EU166979 DQ433047
波斑鹭属Zebrilus 波斑鹭Z. undulatus AF193834 JN802112
牛背鹭属Bubulcus 西方牛背鹭B. ibis DQ485898 AB842593
虎鹭属Tigrisoma 横纹虎鹭T. fasciatum EU166980 JN802047
栗虎鹭T. lineatum AF193831 FJ028443
麻 属Botaurus 大麻B. stellaris AY465748 AB842589
表选项
1.2 总DNA提取及基因扩增

取-80 ℃保存的肌肉样品提取DNA。具体操作参考生工生物工程(上海)股份有限公司的Ezup柱式动物细胞/组织基因组DNA抽提试剂盒中使用说明书的标准抽提步骤。提取DNA后经琼脂糖凝胶电泳, 在凝胶成像仪下观察提取结果, 若出现明显条带且与目的条带长度相近, 则说明已成功提取出样品的总DNA, -20 ℃储存备用。

PCR反应体系为25 μL:5 μL DNA模板+12.5 μL Mix+5.5 μL ddH2O+2 μL引物(上下游引物各1 μL), 其中DNA模板和引物的密度均为10-5 mol·L-1。反应在Applied Biosystems型PCR仪中进行。CO Ⅰ 基因片段扩增选用的引物对为BirdF1(TTCTCCAACCACAAAGACATTGGCAC)和BirdR1(ACGTGGGAGATAATTCCAAATCCTG)(Kerr et al., 2007)。PCR反应条件为:94 ℃ 4 min；94 ℃1 min, 48 ℃ 1 min, 72 ℃ 1 min, 5个循环；94 ℃1 min, 55 ℃ 1 min, 72 ℃ 1 min, 35个循环；72 ℃7 min。Cyt b基因片段扩增选用的引物对为H16067(AGCCTTCAATCTTTGGCTTACAAG)和L14731(AATTGCATCCCACTTAATCGA)(Saetre et al., 2001)。PCR反应条件为:94 ℃ 4 min；94 ℃ 1 min, 48 ℃ 1 min, 72 ℃ 1.5 min, 35个循环；72 ℃ 7 min。在凝胶成像仪下确认PCR产物是目标条带后, 送生工生物工程(上海)股份有限公司进行双向测序。

1.3 DNA序列数据整理及分析

将测序结果用SEQMAN进行拼接并辅以人工校正。结合序列图(abI格式文件), 剪去两端信号较杂乱的序列, 再查看2条链的重叠区, 即在序列的内部进行人工校正。一般情况下, 为保证序列的准确性, 重叠区域的碱基至少≥50 bp(黄原, 1998)。将拼接校正过的DNA序列在NCBI上进行BLAST相似性搜索, 以确保获得的序列为目的基因片段。

运用Clustal W(Thompson et al., 1997)将所有物种的序列进行比对, 再运用MEGA6.0对已经比对好的序列计算碱基组成情况、保守位点、变异位点、简约信息位点等, 用Kimura 2-parameter(K2P)法计算遗传距离。选取除鹭属之外的其他6属7种为外群, 将2段基因合并, 应用MrBayes3.1(Huelsenbeck & Ronquist, 2003)构建贝叶斯树, 运行4个马尔可夫链, 共运行5 000 000代, 至平均标准离差(sd)=0.004 315(只有当sd＜0.01时说明达到收敛, 才可结束运行)。在FigTree 1.4.2中查看和修饰系统树。

2 研究结果 2.1 白腹鹭基因序列特征

白腹鹭Cyt b基因序列共有1 163个位点(表 2)。碱基含量中G最高, C最低, A+T(51.7%)高于G+C(48.3%)。嘧啶含量(39.7%)明显低于嘌呤含量(60.3%)。第一位点和第二位点的A+T均高于G+C, 第三位点的A+T(48.0%)低于G+C(52.0%)。在密码子的不同位点, 碱基频率有不同偏倚, 第二位点上4种碱基含量较接近, 偏倚程度最小；第三位点上G含量增加到46.8%, C含量只有5.2%, 偏倚最突出。

白腹鹭CO Ⅰ 基因序列共有722个位点(表 2)。C含量最高, G含量最低。A+T(52.5%)高于G+C(47.5%)。嘧啶含量(57.0%)高于嘌呤含量(43.0%)。第一位点的A+T(41.5%)低于G+C(58.5%), 第二位点和第三位点的A+T均高于G+C。第一位点上碱基含量比较平均；第二位点上T高达41.0%, A只有14.9%；第三位点上A含量最高, G最少, 碱基偏倚现象在第三位点最明显。

表 2 白腹鹭Cyt b和CO Ⅰ 基因序列的各位点碱基组成 Table 2 Sequence composition of Cyt b and CO Ⅰ genes of Ardea insignis
位点Locus Cyt b/COⅠ
数量Number T/% C/% A/% G/%
第一位点 388/241 22.2/17.0 11.3/28.2 38.4/24.5 28.1/30.3
第二位点 388/241 25.8/41.0 21.9/28.7 26.0/14.9 31.7/15.4
第三位点 387/240 32.8/18.8 5.2/37.4 15.2/41.3 46.8/2.5
合计 1 163/722 26.9/25.6 12.8/31.4 24.8/26.9 35.5/16.1
表选项
2.2 鹭属基因序列特征及种间遗传距离

本研究获得白腹鹭的Cyt b基因片段, 合并来自NCBI的另外5种鹭属鸟类的同源区序列(NCBI中未查询到黑冠白颈鹭A. cocoi的Cyt b基因信息)。经过比对排列后共有822个位点。除了中白鹭A+ T的含量(49.3%)低于G+C的含量(50.7%)外, 其余5种的A+T的含量均高于G+C的含量(表 3)。保守位点650个, 可变位点172个, 简约信息位点47个, 单变异位点125个。物种间序列位点变异表现为转换多于颠换, R(转换/颠换)的平均值为3.46。

本研究获得白腹鹭的CO Ⅰ 基因片段, 合并来自NCBI的另外6种鹭属鸟类的同源区序列, 经过比对排列后共有599个位点。A+T的含量均高于G+C的含量(表 3)。保守位点485个, 可变位点111个, 简约信息位点60个, 单变异位点51个。物种间序列位点变异表现为转换多于颠换, R(转换/颠换)的平均值为10.04。

基于CO Ⅰ 基因计算鹭属各物种间的遗传距离, 白腹鹭与草鹭A. purpurea的遗传距离最小(0.062), 与大白鹭的遗传距离最大(0.093)(表 4)。

表 3 鹭属7种的Cyt b和CO Ⅰ 基因序列组成 Table 3 Base composition of Cyt b and CO Ⅰ genes in the 7 Ardea species
物种Species Cyt b/COⅠ
A+T/% G+C/%
白腹鹭Ardea insignis 51.5/52.0 48.5/48.0
大白鹭Ardea alba 53.1/52.8 46.9/47.2
苍鹭Ardea cinerea 50.2/52.4 49.8/47.6
中白鹭Ardea intermedia 49.3/52.0 50.7/48.0
草鹭Ardea purpurea 50.7/51.8 49.3/48.2
大蓝鹭Ardea herodias 50.8/52.2 49.2/47.8
黑冠白颈鹭Ardea cocoi —/52.2 —/47.8
表选项

表 4 鹭属7种的种间遗传距离 Table 4 Genetic distance between the 7 Ardea species
1 2 3 4 5 6
1.苍鹭Ardea cinerea
2.草鹭Ardea purpurea 0.091
3.大蓝鹭Ardea herodias 0.019 0.096
4.大白鹭Ardea alba 0.129 0.103 0.125
5.白腹鹭Ardea insignis 0.083 0.062 0.082 0.093
6.黑冠白颈鹭Ardea cocoi 0.021 0.091 0.019 0.119 0.077
7.中白鹭Ardea intermedia 0.119 0.095 0.117 0.087 0.083 0.115
表选项
2.3 鹭属系统进化树

基于CO Ⅰ 和Cyt b基因片段构建贝叶斯系统发育树显示(图 1), 鹭属鸟类构成单系(支持率96%)。鹭属7种鸟类中, 最先分化的是大白鹭, 其次是白腹鹭、草鹭。苍鹭A. cinerea、大蓝鹭A. herodias、中白鹭、黑冠白颈鹭聚为一支(支持率97%)。白腹鹭位于鹭属分支内, 单独聚为一支, 无姐妹类群。

图 1 基于Cyt b+CO Ⅰ 基因序列构建的鹭科14种鸟类的贝叶斯树 Fig. 1 Bayes tree of 14 species from family Ardeidae based on Cyt b and CO Ⅰ genes
图选项
3 讨论 3.1 白腹鹭的线粒体基因序列特征

线粒体基因序列的碱基组成研究较多, 对74种鸟类线粒体基因组序列的分析表明, 密码子第二位的G、C含量波动较小, 第三位的波动幅度大, 这与第三位的C、T含量变化有关(高英凯等, 2009)。白腹鹭Cyt b和CO Ⅰ 基因序列的嘧啶和嘌呤含量有明显差异, 同样是由第三位点上G、C含量变化引起, 这与第三位点的变异通常不改变氨基酸编码、受选择压力小有关(钟东等, 2002)。

在鸟类线粒体基因序列中, 碱基组成存在一定的偏向性是普遍存在的现象(Arnaiz-Villena et al., 2001；Webb & Moore, 2005)。偏倚情况可能因物种不同而不同, 对24种雀类的研究表明, Cyt b基因序列密码子第一位点出现的频率相似, 第二位点G的频率明显低于其他3种碱基, 第三位点偏倚G、T(Arnaiz-Villena et al., 2001)。在本研究中, Cyt b基因序列的第一、二位点均无明显偏倚, 但第三位点明显偏倚G, 在该位点上的碱基偏倚与上述雀类研究相似。白腹鹭CO Ⅰ 基因序列的碱基偏倚和Cyt b基因不同, 第一位点没有明显的偏倚, 第二位点偏倚T, 第三位点偏倚A。

3.2 白腹鹭的系统分类地位

根据本文结果, 鹭属7种聚为一支, 该节点有较高的支持率(96%), 支持IOC分类系统中把白腹鹭、大白鹭、中白鹭均放入鹭属中的处理(Gill & Donsker, 2014), 这与目前国内最新的鸟类分类系统相同(郑光美, 2017)。在鹭属中, 白腹鹭是较早分化的物种, 遗传距离分析表明和白腹鹭亲缘关系最近的是草鹭。然而, Rasmussen和Anderton(2005)提及大嘴鹭Ardea sumatrana外部形态特征和白腹鹭最为接近, 但大嘴鹭的物种地位尚不明确, 抑或是白腹鹭的某些地理种群产生了形态分化, 因此, 白腹鹭的系统分类地位还需进一步研究确认。

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