白腹鹭Ardea insignis隶属于鹭科Ardeidae鹭属Ardea(Gill & Donsker, 2014), 是一种体型较大的涉禽, 高达127 cm, 整体呈灰色, 分布于尼泊尔、不丹、印度东北部和缅甸北部, 我国云南西部(Hoyo et al., 1992；韩联宪等, 2015)。自1994年, 白腹鹭被世界自然保护联盟(IUCN)列为濒危(EN)物种, 后升级为极危(CR)物种, 全球数量不足500只(IUCN, 2016)。在《中国脊椎动物红色名录》中, 白腹鹭的现状是缺乏数据(DD)(蒋志刚等, 2016)。对于该物种, 不论是野外分布、种群现状, 还是系统分类、分子生物学研究, 均近于空白。

关于鹭类的系统分类研究历来不多, 或者分类取样十分有限(张保卫等, 2002；常青等, 2003；张国萍等, 2005)。鹭属内的物种归属也一直存在争议。比如, 大白鹭A. alba和中白鹭A. intermedia长期以来被置于白鹭属Egretta(郑作新, 1964, 1994；Hermann et al., 1972；Ben et al., 1975), 但Sibley和Monoroe(1990)根据DNA杂交研究结果, 将大白鹭归入大白鹭属Casmerodius, 中白鹭则独立成中白鹭属Mesophoyx。但在国际鸟类联合会(International Ornithologists Committee, IOC)的鸟类名录和目前国内普遍采用的鸟类分类系统中, 大白鹭和中白鹭都置于鹭属(郑光美, 2017)。对于白腹鹭, 由于缺乏研究, 中国鸟类分类系统一直沿用Peters的分类方式, 将其置于鹭属(Peters, 1945；郑作新, 1964；郑光美, 2017), 但尚无分子系统学的验证。

本研究根据IOC的分类系统, 对鹭属鸟类进行系统发育分析。分子标记采用线粒体DNA中的细胞色素b(cytochrome b, Cyt b)基因和细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(cytochrome oxidase subunit Ⅰ, COⅠ)基因, 它们都被广泛运用于鸟类分类与系统发育关系的研究(Mindell, 1997；Weibel & Moore, 2002；Hebert et al., 2004；Webb & Moore, 2005)。选择鹭属内7种作为内群, 选择鹭科中与鹭属亲缘关系近且有相应基因序列信息的其他6属7种作为外群, 构建系统发育树。

1 材料和方法 1.1 材料

2014年, 在云南泸水发现的1只白腹鹭是该物种在中国分布的第一条确切记录(韩联宪等, 2015)。该个体于云南野生动物园进行救助, 饲养过程中死亡, 我们获得少量实验样品。其余物种的Cyt b和CO Ⅰ 基因序列均来自美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)(表 1)。

1.2 总DNA提取及基因扩增

取-80 ℃保存的肌肉样品提取DNA。具体操作参考生工生物工程(上海)股份有限公司的Ezup柱式动物细胞/组织基因组DNA抽提试剂盒中使用说明书的标准抽提步骤。提取DNA后经琼脂糖凝胶电泳, 在凝胶成像仪下观察提取结果, 若出现明显条带且与目的条带长度相近, 则说明已成功提取出样品的总DNA, -20 ℃储存备用。

PCR反应体系为25 μL:5 μL DNA模板+12.5 μL Mix+5.5 μL ddH₂O+2 μL引物(上下游引物各1 μL), 其中DNA模板和引物的密度均为10^-5 mol·L^-1。反应在Applied Biosystems型PCR仪中进行。CO Ⅰ 基因片段扩增选用的引物对为BirdF1(TTCTCCAACCACAAAGACATTGGCAC)和BirdR1(ACGTGGGAGATAATTCCAAATCCTG)(Kerr et al., 2007)。PCR反应条件为:94 ℃ 4 min；94 ℃1 min, 48 ℃ 1 min, 72 ℃ 1 min, 5个循环；94 ℃1 min, 55 ℃ 1 min, 72 ℃ 1 min, 35个循环；72 ℃7 min。Cyt b基因片段扩增选用的引物对为H16067(AGCCTTCAATCTTTGGCTTACAAG)和L14731(AATTGCATCCCACTTAATCGA)(Saetre et al., 2001)。PCR反应条件为:94 ℃ 4 min；94 ℃ 1 min, 48 ℃ 1 min, 72 ℃ 1.5 min, 35个循环；72 ℃ 7 min。在凝胶成像仪下确认PCR产物是目标条带后, 送生工生物工程(上海)股份有限公司进行双向测序。

1.3 DNA序列数据整理及分析

将测序结果用SEQMAN进行拼接并辅以人工校正。结合序列图(abI格式文件), 剪去两端信号较杂乱的序列, 再查看2条链的重叠区, 即在序列的内部进行人工校正。一般情况下, 为保证序列的准确性, 重叠区域的碱基至少≥50 bp(黄原, 1998)。将拼接校正过的DNA序列在NCBI上进行BLAST相似性搜索, 以确保获得的序列为目的基因片段。

运用Clustal W(Thompson et al., 1997)将所有物种的序列进行比对, 再运用MEGA6.0对已经比对好的序列计算碱基组成情况、保守位点、变异位点、简约信息位点等, 用Kimura 2-parameter(K2P)法计算遗传距离。选取除鹭属之外的其他6属7种为外群, 将2段基因合并, 应用MrBayes3.1(Huelsenbeck & Ronquist, 2003)构建贝叶斯树, 运行4个马尔可夫链, 共运行5 000 000代, 至平均标准离差(sd)=0.004 315(只有当sd＜0.01时说明达到收敛, 才可结束运行)。在FigTree 1.4.2中查看和修饰系统树。

2 研究结果 2.1 白腹鹭基因序列特征

白腹鹭Cyt b基因序列共有1 163个位点(表 2)。碱基含量中G最高, C最低, A+T(51.7%)高于G+C(48.3%)。嘧啶含量(39.7%)明显低于嘌呤含量(60.3%)。第一位点和第二位点的A+T均高于G+C, 第三位点的A+T(48.0%)低于G+C(52.0%)。在密码子的不同位点, 碱基频率有不同偏倚, 第二位点上4种碱基含量较接近, 偏倚程度最小；第三位点上G含量增加到46.8%, C含量只有5.2%, 偏倚最突出。

白腹鹭CO Ⅰ 基因序列共有722个位点(表 2)。C含量最高, G含量最低。A+T(52.5%)高于G+C(47.5%)。嘧啶含量(57.0%)高于嘌呤含量(43.0%)。第一位点的A+T(41.5%)低于G+C(58.5%), 第二位点和第三位点的A+T均高于G+C。第一位点上碱基含量比较平均；第二位点上T高达41.0%, A只有14.9%；第三位点上A含量最高, G最少, 碱基偏倚现象在第三位点最明显。

2.2 鹭属基因序列特征及种间遗传距离

本研究获得白腹鹭的Cyt b基因片段, 合并来自NCBI的另外5种鹭属鸟类的同源区序列(NCBI中未查询到黑冠白颈鹭A. cocoi的Cyt b基因信息)。经过比对排列后共有822个位点。除了中白鹭A+ T的含量(49.3%)低于G+C的含量(50.7%)外, 其余5种的A+T的含量均高于G+C的含量(表 3)。保守位点650个, 可变位点172个, 简约信息位点47个, 单变异位点125个。物种间序列位点变异表现为转换多于颠换, R(转换/颠换)的平均值为3.46。

本研究获得白腹鹭的CO Ⅰ 基因片段, 合并来自NCBI的另外6种鹭属鸟类的同源区序列, 经过比对排列后共有599个位点。A+T的含量均高于G+C的含量(表 3)。保守位点485个, 可变位点111个, 简约信息位点60个, 单变异位点51个。物种间序列位点变异表现为转换多于颠换, R(转换/颠换)的平均值为10.04。

基于CO Ⅰ 基因计算鹭属各物种间的遗传距离, 白腹鹭与草鹭A. purpurea的遗传距离最小(0.062), 与大白鹭的遗传距离最大(0.093)(表 4)。

2.3 鹭属系统进化树

基于CO Ⅰ 和Cyt b基因片段构建贝叶斯系统发育树显示(图 1), 鹭属鸟类构成单系(支持率96%)。鹭属7种鸟类中, 最先分化的是大白鹭, 其次是白腹鹭、草鹭。苍鹭A. cinerea、大蓝鹭A. herodias、中白鹭、黑冠白颈鹭聚为一支(支持率97%)。白腹鹭位于鹭属分支内, 单独聚为一支, 无姐妹类群。

3 讨论 3.1 白腹鹭的线粒体基因序列特征

线粒体基因序列的碱基组成研究较多, 对74种鸟类线粒体基因组序列的分析表明, 密码子第二位的G、C含量波动较小, 第三位的波动幅度大, 这与第三位的C、T含量变化有关(高英凯等, 2009)。白腹鹭Cyt b和CO Ⅰ 基因序列的嘧啶和嘌呤含量有明显差异, 同样是由第三位点上G、C含量变化引起, 这与第三位点的变异通常不改变氨基酸编码、受选择压力小有关(钟东等, 2002)。

在鸟类线粒体基因序列中, 碱基组成存在一定的偏向性是普遍存在的现象(Arnaiz-Villena et al., 2001；Webb & Moore, 2005)。偏倚情况可能因物种不同而不同, 对24种雀类的研究表明, Cyt b基因序列密码子第一位点出现的频率相似, 第二位点G的频率明显低于其他3种碱基, 第三位点偏倚G、T(Arnaiz-Villena et al., 2001)。在本研究中, Cyt b基因序列的第一、二位点均无明显偏倚, 但第三位点明显偏倚G, 在该位点上的碱基偏倚与上述雀类研究相似。白腹鹭CO Ⅰ 基因序列的碱基偏倚和Cyt b基因不同, 第一位点没有明显的偏倚, 第二位点偏倚T, 第三位点偏倚A。

3.2 白腹鹭的系统分类地位

根据本文结果, 鹭属7种聚为一支, 该节点有较高的支持率(96%), 支持IOC分类系统中把白腹鹭、大白鹭、中白鹭均放入鹭属中的处理(Gill & Donsker, 2014), 这与目前国内最新的鸟类分类系统相同(郑光美, 2017)。在鹭属中, 白腹鹭是较早分化的物种, 遗传距离分析表明和白腹鹭亲缘关系最近的是草鹭。然而, Rasmussen和Anderton(2005)提及大嘴鹭Ardea sumatrana外部形态特征和白腹鹭最为接近, 但大嘴鹭的物种地位尚不明确, 抑或是白腹鹭的某些地理种群产生了形态分化, 因此, 白腹鹭的系统分类地位还需进一步研究确认。