虽然以圈养为模式的大熊猫迁地保护繁育计划基本实现了圈养大熊猫种群数量以及遗传多样性的自我维持(Xie，2016)，但从福利角度看其圈养模式存在一定弊端，如生存环境固定单一和空间狭小、育幼期过早的母子分离、饲喂时间固化以及刺激缺乏等，这些模式导致对大熊猫必需行为的剥夺、本能行为表达的抑制和异常行为表现的增加(Liu et al., 2003；张志和，魏辅文，2006)，影响大熊猫正常行为的充分表达。圈养大熊猫暴露的一些生产上的实际问题(如自然繁殖能力差)始终没有得到解决(Swaisgood et al., 2003, 2006)，严重影响了圈养大熊猫野外放归计划的实施，不符合科学繁育、健康饲养的大熊猫迁地保护国家战略。造成这些问题的原因极有可能与圈养生活环境不能够满足大熊猫对各种生理需求(包括对配偶以及环境舒适度的需求)的自由选择，择偶和交配等自然本能行为不能够充分表达或被抑制有关(Zhang et al., 2004；Martin-Wintle et al., 2015, 2018, 2020)。

育幼期是动物身体发育，包括神经发育、肌肉骨骼发育的关键时期，缺乏足够的新鲜刺激，会影响神经发育(Hall，1998；Latham & Mason，2008)。圈养人工育幼环境单调、狭小以及多种非自然应激源的干扰(游客噪音、更换兽舍以及非自然的多种气味等)，会给育幼期母兽造成压力，导致抚育幼仔时不能为幼仔提供更多的学习和锻炼机会，同时，也在一定程度上对育幼期的幼仔造成应激，限制了幼仔公兽先天性本能的激发和发育，最终可能会导致圈养大熊猫自然行为的丧失(Zhu et al., 2001；Garshelis，2004)。与育幼期近自然的全母乳育幼方式相比，非自然的人工辅助育幼方式会造成圈养成年大熊猫刻板行为的频繁发生(Zhang et al., 2021)，同时，育幼期不同的育幼方式(全母乳近自然育幼vs.人工辅助育幼)会显著影响雄性大熊猫幼仔成年后的自然交配行为的表达以及繁殖效率(Zhang et al., 2021)。由此推测，育幼早期(幼仔0~4月龄)采取接近自然的育幼方式以及成长环境对大熊猫幼仔自然行为(尤其是自然交配行为)的表达非常重要。

目前，对于育幼期圈养大熊猫的应激方面以及育幼经历对幼仔行为发育影响方面的研究较少，集中在母兽育幼行为表达的环境影响因素方面(Zhang et al., 2000；Snyder et al., 2016；Heiderer et al., 2018)。虽然中国大熊猫保护研究中心以及奥地利维也纳动物园等都曾经尝试为临产大熊猫修建人工育幼巢穴，使其像野生大熊猫一样进行自然的育幼，但这对于幼仔的行为发育以及成年后的自然交配能力是否有影响却没有报道(Snyder et al., 2003；Li et al., 2017)。Heiderer等(2018)首次介绍了奥地利动物园利用人工育幼巢穴成功育幼大熊猫双胞胎的案例，重点介绍了育幼期双胞胎与母兽的行为情况；Snyder等(2016)对圈养大熊猫育幼期母兽及幼仔的行为作了比较全面的描述，并得到了经产母兽比初产母兽有更好育幼行为的结果；虽然Snyder等(2003)的研究结果显示，母子分离对雄性和雌性幼仔行为的影响不同，且同伴养育不能给幼仔提供与母兽养育相同水平的社会刺激，但此实验没有研究母子分离对成年大熊猫福利的影响。同时，圈养环境中多种非自然应激源(游客噪音、更换兽舍以及非自然的多种气味等)，也是造成圈养大熊猫心理应激的重要因素。饲养模式对大熊猫行为以及生理免疫方面影响的研究集中在环境丰容(活动空间、环境丰富度等)和物件丰容(新奇事物刺激)对圈养大熊猫刻板行为、行为多样性以及活动节律等方面(Liu et al., 2003；Swaisgood et al., 2005；Liu et al., 2006；Liu et al., 2017)。目前能够反映圈养大熊猫应激水平的激素类指标并不多，最具代表性的为粪便和尿液中皮质醇的含量(Owen et al., 2004；Liu et al., 2006)。

因此，在前期研究的基础上，本研究旨在探讨育幼期不同的育幼模式对圈养成年雌性大熊猫尿液皮质醇含量的影响，了解圈养育幼模式可能引发成年雌性大熊猫的应激问题，为完善育幼期圈养大熊猫圈舍的设计，以及提高圈养大熊猫的福利水平提供科学依据。

选择成都大熊猫繁育研究基地9只育幼期成年雌性大熊猫为研究对象，分为3组，每组3只：第一组是母兽生育单胎幼仔，采取全母乳育幼的方式；第二组是母兽生育单胎幼仔，采取母兽和人工交替的常规人工辅助育幼的方式；第三组是母兽生育双胎幼仔，采取母兽和人工交替的常规人工辅助育幼的方式。

幼仔1.5~2岁自然断奶前，与母兽共同生活在育幼期圈舍内，待幼仔可以走动后，让其与母兽随意选择圈舍内、圈舍外出入。断奶后采取逐步分离母子的方式，减少分离产生的应激。

无论是全母乳育幼还是常规人工辅助育幼，前期(幼仔0~3月龄)均在圈舍中进行。单胎全母乳的育幼方式中幼仔主要与母兽一起饲养，母兽与幼仔分离的机会少、时间短(幼仔每次离开母兽进行体检或人工补奶的时间不超过2 min，整个育幼前期幼仔离开母兽的总时间不超过180 min)。为保证幼仔的健康，兽舍两侧增加了2扇推拉门，幼仔发生突发情况时可透过圈舍栏杆开门取出。常规人工辅助育幼的方式中幼仔主要在保温箱中生活，与母兽经常分离。

收集育幼期第1周、第4周、第8周和第12周(每周3 d)成年雌性大熊猫的晨尿样品(07∶ 00—09∶ 00)，-20 ℃保存。所有尿液样本均从坚实、清洁的地板上吸出，不与粪便或水接触，避免交叉污染和稀释。

利用ELISA方法检测尿液皮质醇含量。相关试剂、标准品和稀释液的配制方法与步骤按照Cayman的尿液Cortisol ELISA Kit试剂盒的要求进行。

标准品制备：准备6支干净试管，分别标号100、50、25、12.5、6.25和0。用肌酐标准品原液(100 μg·mL^-1，4 ℃保存)和TRIZMA Buffer进行2倍稀释：向标号100的试管加入400 μL肌酐标准品原液，室温放置恢复至常温，涡旋充分混匀，标号0~50的试管分别加入200 μL TRIZMA Buffer，从标号100的试管吸取200 μL肌酐标准品原液至标号50的试管，充分涡旋混匀；再从标号50的试管吸取200μL肌酐标准品稀释液至标号25的试管，充分涡旋混匀；再从标号25的试管吸取200 μL肌酐标准品稀释液至标号12.5的试管，充分涡旋混匀；再从标号12.5的试管吸取200 μL肌酐标准品稀释液至标号6.25的试管，充分涡旋混匀。

1) 加样：取干净的96孔酶标板标记肌酐字样，向前4个孔分别加入50 μL配好的肌酐标准品(0~100，每个稀释度加2个孔)，从第5个孔开始，每个孔加入待测尿样稀释液50 μL(每个稀释度加2个孔)；每个孔用排枪隔空分别依次加入50 μL ddH₂O，50 μL 0.75N NaOH，50 μL 0.4 N苦味酸；轻晃酶标板，室温放置15 min后读数。

2) 读板：492 nm波长下读数。

A=肌酐含量(mg·mL^-1)=[肌酐(μg·mL^-1)×稀释倍数]/1 000；B=皮质醇含量(pg·mL^-1)=每孔皮质醇含量(pg/well)×稀释倍数；C=肌酐矫正皮质醇含量(cortisol ng/mg Cr)=B/A/1 000。

实验数据用SPSS 23.0进行统计分析，尿液皮质醇指标数据用Nonparametric Tests的One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test进行正态检验。使用一般线性模型的方法检验不同育幼时间(第1周vs.第4周vs.第8周)和育幼方式(全母乳育幼单胎vs.人工辅助育幼单胎vs.人工辅助育幼双胎)对圈养成年雌性大熊猫尿液皮质醇含量的影响；之后，同样使用一般线性模型的方法分析不同育幼经验(初产vs.经产)和育幼时间(第4周vs.第8周vs.第12周)对圈养成年雌性大熊猫尿液皮质醇含量的影响，用LSD法进行多重比较，所有结果均表示为x±SE，显著水平为α=0.05。

生理指标结果表明，育幼早期(前8周)的育幼时间和育幼方式均对圈养成年雌性大熊猫尿液皮质醇含量有显著影响(育幼时间：F_{2, 81}=165.682，P < 0.01；育幼方式：F_{2, 81}=75.091，P < 0.01)，其中，随着幼仔年龄增长，圈养成年雌性大熊猫尿液皮质醇含量显著增加；在育幼期第1、4和8周，人工辅助育幼组母兽的尿液皮质醇含量显著高于全母乳育幼单胎组；育幼方式与育幼时间之间的交互作用明显(F_{4, 81}=3.841，P < 0.01；图 1)。

图 1 育幼期不同的育幼方式和时间对圈养成年雌性大熊猫尿液皮质醇含量的影响 Fig. 1 Effects of different nursing methods and durations on the urine cortisol concentrations of captive female giant pandas during the nursing period ** P＜0.01；下同the same below

图选项

育幼早期(前12周)的育幼时间和育幼经验对圈养成年雌性大熊猫尿液皮质醇含量均有显著的影响(育幼时间：F_{2, 81}=91.531，P < 0.01；育幼经验：F_{1, 81}=58.305，P < 0.01)，其中，育幼期第4周和第12周，经产成年雌性大熊猫尿液皮质醇含量均显著低于初产；另外，随着幼仔年龄增长，圈养成年雌性大熊猫尿液皮质醇含量均显著增加；但育幼经验与育幼时间之间的交互作用不明显(F_{2, 81}=1.940，P=0.151；图 2)。

图 2 育幼期不同的育幼经验和时间对圈养成年雌性大熊猫尿液皮质醇含量的影响 Fig. 2 Effects of different nursing experience and durations on the urine cortisol concentrations of captive female giant pandas during the nursing period

图选项

本研究发现，育幼期前12周，采取人工辅助育幼方式的成年雌性大熊猫尿液皮质醇的含量显著高于采取全母乳育幼方式，这表明，人工辅助育幼的方式对育幼期圈养成年雌性大熊猫产生了应激，这也补充了我们前期的行为学研究结果：人工辅助的育幼方式减少了育幼期母兽与幼仔在一起的时间，导致母兽在与幼仔分离后产生频繁的踱步以及针对栏杆祈求幼仔等刻板行为(Zhang et al., 2021)。动物福利学者认为，刻板行为的出现可能标志着动物对生存环境的不适应以及正在遭受心理痛苦(Broom，1986)。除了行为表现外，激素水平也在一定程度上反映了圈养大熊猫存在心理不适的问题。前人研究发现，不利环境因素(噪音等)会造成圈养大熊猫粪便和尿液皮质醇水平显著升高(Owen et al., 2004；Liu et al., 2006；Powell et al., 2006)。大量人类临床研究证实，慢性心理应激与下丘脑-垂体-肾上腺轴的功能紊乱有关，而皮质醇正是调节该轴功能的重要激素，即过量的皮质醇水平预示着心理不适的存在(Sapolsky et al., 2000)。在幼仔离开后，母兽心理受到了严重的创伤，而这可能与育幼前期母兽的母性行为被激发但表达受到人为抑制有关。Latham和Mason(2008)的报道也已经证实了育幼期过早的母子分离会促进幼仔刻板行为的发育，而本实验做了很好的补充，证明了育幼期长时间的母子分离也会导致母兽尿液皮质醇含量的显著上升。

本实验还发现，有育幼经验的经产圈养成年雌性大熊猫尿液皮质醇含量显著低于没有育幼经验的初产母兽，这说明，经产的圈养母兽在育幼前期的应激水平低于初产的母兽，也从侧面说明具有育幼经验的经产母兽对环境的适应性更强，这可能与经验效应有关。前期对妊娠期母猪的研究结果也发现，有妊娠期限位经验的母猪要比初次经历限位饲养的表现出更少的刻板行为以及应激相关的血液皮质醇、IgA和IL-6含量更低，这说明不利的经验效应可以缓解动物的应激水平，使其更容易适应不利的生存环境(Zhang et al., 2017)。同时，育幼前期不同的育幼环境应激是否对幼仔的行为发育(尤其是自然交配行为的表达)以及性格等情绪认知方面有影响还不清楚(Zhang et al., 2017)，有待后期继续深入的研究。

由于每年圈养大熊猫繁育数量有限，试验样本量较小，在统计分析中有可能出现假显性现象，希望后期积累新的圈养大熊猫育幼数据以验证本试验的结论。

本实验发现，与全母乳育幼方式相比，人工辅助育幼的方式会使圈养成年雌性大熊猫尿液中皮质醇的含量显著升高，造成严重的心理焦虑。因此，在圈养环境下，采取全母乳育幼的方式是符合大熊猫自然育幼特点且有利于母兽福利的育幼方式。

致谢: 感谢给予本研究帮助的成都大熊猫繁育研究基地的大熊猫饲养员和工作人员。