昆虫的化学感受系统在其生存和繁殖过程中起着极其重要的作用(Kaupp，2010；Sun et al., 2014；Zhang et al., 2015)。研究者对昆虫触角嗅觉信号传导的分子机制研究有了突出的进步：在昆虫嗅觉识别时，气味分子从触角感器孔渗入，然后被气味结合蛋白(odorant binding proteins，OBPs)或化学感受蛋白(chemosensory proteins，CSPs)识别和转移，最后激活位于嗅觉感觉神经元(olfactory sensory neurons，OSNs)树突膜上的嗅觉受体(odorant receptors，ORs)或离子型受体(ionotropic receptors，IRs)，产生电位，指导昆虫做出相应的行为反应(Benton et al., 2009；Leal，2013；Brito et al., 2016；de Fouchier et al., 2017；Yang et al., 2017)。此外，还有一些蛋白如感觉神经元膜蛋白(sensory neuron membrane proteins，SNMPs)在昆虫气味识别过程中也扮演着至关重要的角色(Leal，2013)。

昆虫SNMPs是一种膜蛋白，与脊椎动物CD36家族为同源基因，具有2个跨膜区域，其功能主要是识别和转运亲脂性气味分子如脂肪酸和脂类化合物等(Rogers et al., 1997, 2001a；Febbraio & Silverstein，2007；Levy et al., 2007；Vogt et al., 2009；Martin et al., 2011)。昆虫第一个 SNMP 基因被鉴定在多音蚕蛾Antheraea polyphemus中，命名为ApolSNMP1。随后 SNMP 的第二个亚类型在烟草天蛾Mauduca sexta中被发现，命名为MsexSNMP2(Rogers et al., 1997, 2001a, 2001b)。紧接着SNMP的同源基因在鳞翅目Lepidoptera(Rogers et al., 2001a, 2001b；Forstner et al., 2008)、双翅目Diptera(Jin et al., 2008)、鞘翅目Coleoptera(Nichols & Vogt，2008)、直翅目Orthoptera(Vogt et al., 2009)和膜翅目Hymenoptera(Hu et al., 2013)等昆虫中都有发现。SNMP 基因家族一直以来被认为只有2个成员，即SNMP1和SNMP2。而昆虫SNMP家族的第三个成员SNMP3在鳞翅目中被鉴定(Zhang et al., 2018)，被认为主要与昆虫的免疫反应有关，这还需要进一步证明。

双委夜蛾Athetis dissimilis属鳞翅目夜蛾科Noctuidae委夜蛾属Athetis，近年逐渐成为小麦Triticum aestivum和玉米Zea mays地的主要害虫。外形类似于二点委夜蛾A. lepigone，食量极大，对小麦和玉米产量造成极大的威胁(王振营等，2012；郭婷婷等, 2016a, 2016b)，发展新型友好的杀虫剂迫在眉睫。本研究鉴定了双委夜蛾的2个SNMP基因，即AdisSNMP1和AdisSNMP2，并通过荧光定量PCR技术对双委夜蛾AdisSNMP1和AdisSNMP2在不同组织中的表达情况进行分析。以期为进一步探索双委夜蛾SNMPs的化学通讯功能奠定基础。

1 材料与方法 1.1 试虫的准备

双委夜蛾来自河南科技大学林学院昆虫实验室，该群体为自2012年7月在河南省洛阳市周边玉米田诱集的成虫，在室内继代饲养至今(宋月芹等，2015)。室内饲养条件为：温度27 ℃±1 ℃，相对湿度80%±5%，光周期16L∶ 8D。

1.2 总RNA的提取与第一链cDNA的合成

选取双委夜蛾羽化后第3天的雌雄成虫，收集触角各50头、头部各30头、胸部各20头、腹部各3头、足各30头、翅各50头，每个样品收集重复3次。将双委夜蛾各部分组织解剖后立即放入浸在液氮中的1.5 mL离心管内，-80 ℃保存。

总RNA的提取采用RNAiso Plus Kit(TaKaRa，北京)试剂盒进行，并使用RNase-free DNase I(TaKaRa，北京)对提取的RNA进行除DNA处理。采用1%琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop 2000c分光光度计(Thermo Scientific)进行质量检测。采用PrimeScript^TM 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa，北京)试剂盒对RNA进行反转录。

1.3 双委夜蛾SNMPs基因的克隆

从本实验室前期对双委夜蛾触角转录组测序注释结果中(Dong et al., 2016)搜索到2个 SNMP 基因。根据该序列设计特异性引物，AdisSNMP1-F：5’-ATGGCGCTTCCTAAGGAGATA-3’，AdisSNMP1-R：5’-AATGTACAACTAGAACCGACC-3’；AdisSNMP2-F：5’-ATGTTGGGAAAACATTCGAAAATG-3’，AdisSNMP2-R：5’-AGTTAAGGGAAATAATTGCACTC-3’。PCR反应体系为20 μL：雌蛾触角cDNA模板1 μL，上、下游引物各1.5 μL (10 μmol·L^-1)，dNTPs混合液1.6 μL(2.5 μmol·L^-1)，Ex Taq DNA聚合酶0.2 μL(TaKaRa，大连)，10×Ex Taq buffer 2 μL，ddH₂O 12.2 μL。PCR反应条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；最后72 ℃ 10 min。胶回收目的片段，将目的片段克隆到pMDTM19-T载体上，转化DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆培养过夜，送去测序。

1.4 双委夜蛾SNMPs基因的序列分析

核酸序列采用在线工具(http://www.bio-soft.net/sms/)翻译；采用在线工具(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)进行跨膜区域预测；利用在线工具(https://web.expasy.org/protparam/)对蛋白序列特性进行分析；采用在线工具(https://web.expasy.org/protscale/)分析蛋白亲疏水性；采用线下DNAMAN进行多重序列比对；采用线下MEGA 6.0构建进化树。

1.5 荧光定量PCR

通过荧光定量PCR检测双委夜蛾SNMPs基因在不同组织中的表达情况。根据双委夜蛾SNMPs基因的开放阅读框和荧光定量引物设计原则设计特异性引物(5'-3')，AdisSNMP1-F：TCCTGTTCCCTGTCATACTCAA，AdisSNMP1-R：GTGCCCTCTCCTTTAGTAACAG，AdisSNMP2-F：CTGCTCTACTAACGGTCCACGA，AdisSNMP2-R：ACGAAACCCTGACCACACGCCT。内参基因为双委夜蛾GADPH基因，引物为：AdisGADPH-F：CTGCTCATTTAGAGGGTGGTGC；AdisGADPH-R：TCTTCTGGGTAGCGGTGGTAG。

荧光定量PCR在ABI 7500 PCR仪(ABI，Carlsbad，CA，USA)上进行，每个反应体系20 μL，包括10 μL的2×SYBR Green PCR Master Mix(TaKaRa，大连)、0.8 μL的正反向引物(10 μmol·L^-1)、2 μL的cDNA模板(200 ng)和6.4 μL的DEPC水。PCR程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s，40个循环。试验重复3次。

1.6 数据分析

所有SNMPs基因在双委夜蛾不同组织中的相对表达量为ΔC_t=C_{t目标基因}-C_{t内参基因}。利用SPSS 17.0中的ANOVA方法对AdisSNMPs基因在双委夜蛾不同组织中的表达量进行差异比较(新复极差法检验，P≤0.05)。

2 结果与分析 2.1 双委夜蛾SNMPs基因克隆及序列特征

反转录及PCR结果(图 1)显示，在1 000~ 2 000 bp之间有1条明显的单一条带，结果与预期大小相符。测序结果在NCBI上的同源性搜索结果表明，所测序列与多种昆虫的SNMP基因序列高度同源，证明这2个基因就是双委夜蛾的SNMP基因，分别命名为AdisSNMP1和AdisSNMP2，GenBank登录号分别为MT954936和MT954937。

这2个SNMPs基因都具有全长的开放阅读框，AdisSNMP1长度为1 572 bp，编码523个氨基酸(图 2)；而AdisSNMP2长度为1 563 bp，编码520个氨基酸(图 3)。这2个基因编码蛋白质都是酸性，AdisSNMP1的等电点是5.96，蛋白分子量是59.09 kD；AdisSNMP2的等电点是5.69，蛋白分子量是58.72 kD。

AdisSNMP1和AdisSNMP2都有3个短的膜内区域，分别是1~8，482~523和1~8，9~28；还有3个跨膜区域，分别是9~31，459~481和9~28，472~494；剩余部分32~458和29~471分别为这2个蛋白的膜外区域(图 4)。在膜外区域6个保守的半胱氨酸残基位点被预测，并组成3个二硫键，AdisSNMP1的二硫键位点是Cys268-Cys333、Cys297-Cys352和Cys335-Cys341，AdisSNMP2的是Cys267-Cys337、Cys298-Cys350和Cys339-Cys361(图 4)。这6个保守的半胱氨酸位点与CD36基因家族相似。

双委夜蛾2个SNMPs基因的亲水性和疏水性预测发现，AdisSNMP1和AdisSNMP2在氨基酸序列的C-端和N-端跨膜区域有2个明显的疏水位点(图 5)。

2.2 双委夜蛾SNMPs与其他昆虫SNMP基因的同源性及进化树分析

将双委夜蛾AdisSNMP基因与已报道的其他昆虫SNMP基因的氨基酸序列在NCBI中的Blastp在线搜索工具进行同源性分析，发现AdisSNMP基因与不同种类昆虫SNMP基因差别较大。与同目昆虫SNMP基因一致性较高，如AdisSNMP1与小地老虎Agrotis ipsilon AipsSNMP1序列一致性为85.69%；与斜纹夜蛾Spodoptera litura SlitSNMP1序列一致性为86.64%。AdisSNMP2与小地老虎AipsSNMP2序列一致性为86.54%；与斜纹夜蛾SlitSNMP2序列一致性为85.38%。与不同目昆虫 SNMP 基因一致性较低，如AdisSNMP1与烟飞虱Bemisia tabaci BtabSNMP1序列一致性为33.84%；与茶翅蝽Halyomorpha halys HhalSNMP1序列一致性为37.45%。AdisSNMP2与烟飞虱BtabSNMP2序列一致性为27.27%；与茶翅蝽HhalSNMP2序列一致性为25.52%。双委夜蛾AdisSNMP1和AdisSNMP2序列一致性为27.05%。

使用MEGA 6.0对11种昆虫的SNMP同源基因进行进化树比较。SNMPs基因被分成2个亚组，即SNMP1和SNMP2 (图 6)。双委夜蛾的AdisSNMP1和AdisSNMP2基因分别被聚集到这2个亚组，并且与同为鳞翅目昆虫的小地老虎和斜纹夜蛾SNMP基因进化关系最近，与其他目昆虫SNMP关系较远。

2.3 双委夜蛾SNMPs基因表达谱分析

使用荧光定量PCR对双委夜蛾AdisSNMP1和AdisSNMP2在不同组织中的表达情况进行分析，结果发现：AdisSNMP1和AdisSNMP2在雌雄蛾触角中高度表达，雄蛾的表达量普遍比雌蛾高。除触角外，AdisSNMP1几乎不在其他组织中表达或表达量甚微。AdisSNMP2除在触角中表达量丰富外，在足中也有少量表达(图 7)。

3 讨论

本研究根据前期双委夜蛾触角转录组的数据，通过BLASTX在线搜索和同源性比较鉴定出2个SNMPs基因，即AdisSNMP1和AdisSNMP2。这2个基因与其他昆虫SNMPs具有类似的特征，如在氨基酸序列N端和C端附近有2个保守的跨膜区域，并且由6个保守的半胱氨酸残基形成二硫键组成一个大的胞外环，此结构也与CD36基因家族极其相似(Huang et al., 2016；Sun et al., 2019；Yang et al., 2020)。根据对这2个跨膜蛋白结构投影预测，这部分的功能是转运和结合脂类分子(Herboso et al., 2011；Pregitzer et al., 2014)，推测双委夜蛾SNMPs的2个跨膜区具有同样的功能。

双委夜蛾AdisSNMP基因同源性搜索发现AdisSNMP基因与不同种类昆虫SNMP基因差别较大。与同目昆虫SNMP基因一致性较高，与不同目昆虫SNMP基因一致性较低。双委夜蛾AdisSNMP1和AdisSNMP2之间序列一致性也比较低。进化树结果也显示，双委夜蛾AdisSNMP1和AdisSNMP2分别被聚集到SNMP1和SNMP2，在同一组内，同为鳞翅目昆虫的SNMP基因进化关系最近，与其他目昆虫SNMP关系较远。此结果与大多数昆虫SNMP基因特性相同(Gu et al., 2013；胡颖颖等，2013；Yang et al., 2020)。在鳞翅目中曾经鉴定出SNMP3亚家族基因(Zhang et al., 2018)，而在双委夜蛾触角转录组数据中没有发现该基因，可能是这个基因在幼虫肠中高度表达的原因。

组织特异性表达可以为功能预测提供可靠性的参考。本研究发现双委夜蛾SNMP1主要表达在雌雄蛾的触角中，此结果与多音蚕蛾(Rogers et al., 1997)、脐橙螟Amyelois transitella(Leal et al., 2009)和甜菜夜蛾Spodoptera exigua(Liu et al., 2014)等多种昆虫SNMP1的表达模式相同。Benton等(2007)在黑腹果蝇Drosophila melanogaster中发现，DmelSNMP1能够识别集合信息素cVA，激活受体HR13。Pregitzer等(2014)在烟芽夜蛾Heliothis virescens中也发现，HvirSNMP1能明显增强HR13对信息素Z11-16:Ald的结合力。以上研究都暗示昆虫SNMP1的功能是调节信息素的识别和通过SNMP-OR互作转运信息素。相对于AdisSNMP1，AdisSNMP2的表达相对广泛，除嗅觉感器触角外，在非嗅觉感器足中也有少量表达，此结果与小菜蛾Plutella xylostella(Li & Qin，2011)、二化螟Chilo suppressalis(Liu et al., 2013a)、稻纵卷叶螟Cnaphalocrocis medinalis (Liu et al., 2013b)和甜菜夜蛾(Liu et al., 2014)一致。昆虫身体上分布有大量的味觉感器(Montell，2009)，而CD36蛋白的主要功能是转运脂类化合物，因此可推测AdisSNMP2和GRs在这些组织中共同表达，识别脂类分子完成味觉过程。

本研究通过前期双委夜蛾触角转录组数据鉴定出2个SNMPs基因，并且研究了这些基因在双委夜蛾不同组织中的表达情况，不仅丰富了昆虫SNMPs基因的数量，也为今后对双委夜蛾SNMPs基因功能的研究提供参考。