绿尾虹雉 Lophophorus lhuysii属鸡形目Galliformes雉科Phasianidae虹雉属，为我国特有高山雉类，分布于甘肃东南部、西藏东北部、青海东南部、云南西北部和四川；终年生活于林线以上，多见于海拔3 500~4 200 m的高山草甸、灌丛和裸岩地带，尤其偏好多陡崖和岩石的高山灌丛和灌丛草甸(卢汰春，1991)。世界自然保护联盟(IUCN)濒危物种红色名录将绿尾虹雉列为易危(VU)物种，濒危野生动植物种国际贸易公约(CITES)将其列入附录Ⅰ；绿尾虹雉被列为我国国家Ⅰ级重点保护野生动物，被《中国脊椎动物红色名录》评估为濒危(EN)物种(蒋志刚等，2016)。迁地保护方面，1955年绿尾虹雉最早在北京动物园圈养展出并逐渐开始繁殖(李福来，1989)，随后的几十年间国内外研究人员相继在人工繁育技术、繁殖行为和疾病的预防治疗等方面开展了一些研究(Rimlinger & Witman，1986；Kuehler & Lieberman，1989；程彩云等, 1993, 1996；陶玉静，陈辉，1999)。由于绿尾虹雉的高原特性，多年来在迁地保护过程中面临着诸多难点，2014年后，除四川宝兴维持一个小规模人工种群外，其他地区的圈养个体相继死亡(张敬等，2019a)。因此，有必要继续加强绿尾虹雉人工繁育的研究，为将来开展迁地保护提供条件。

四川宝兴蜂桶寨绿尾虹雉保护研究中心(简称研究中心)成立于1992年，2017年有11只个体，由于孵化设备和技术的限制，卵的孵化率一直较低(张敬等，2019a)。2018—2019年进行了绿尾虹雉卵人工孵化研究，探索卵的最佳孵化方案并积累经验。

1 材料与方法 1.1 种鸟及饲养

实验用卵来自研究中心圈养的4组种鸟，由2004年野外个体及其后代组成。饲养方式：非繁殖期，1只雄鸟与1~3只雌鸟同笼饲养；繁殖期，1雌1雄配对后同笼单独饲养。产卵后将卵捡出，进行人工孵化和育雏。饲养笼舍长10.0 m×宽3.5 m×高2.8 m。每日喂食2次，饲料有：鸡蛋、面包虫、白菜、折耳根、西红柿、洋葱、大蒜、玉米、商品颗粒饲料，繁殖期前补充钙质。

1.2 研究方法

我国动物园鸟卵人工孵化始于20世纪60年代，孵化温度主要采用家禽孵化中“看胎施温”的方法控制，用测量卵的水分散失率和气室大小调节孵化湿度(李福来，1989；张敬等，2017)。对多种鸟卵孵化的实践发现，大多数鸟卵在孵化过程中水分散失，会减少初始重量的12%~15%，如果通过称量卵失重的方法来监测孵化，增加或减少孵化机内部湿度，将这个损失控制在个别物种的要求范围内，卵成功孵化的可能性将会大大提高(Harvey，1993；Brown & Robbins，2002；张敬等，2019b)。人工孵化时使用2台或多台孵化机，在不同的湿度下运行，根据卵的质量曲线读数将卵转移到不同湿度孵化机中孵化。这种技术被应用在鹦鹉、雉类、企鹅和走禽类的人工孵化中，都取得了理想的效果(Brown & Robbins，2002；张敬等，2019b)。因此，本研究采用不同湿度孵化绿尾虹雉卵，旨在探索不同湿度对卵孵化结果的影响，同时寻找绿尾虹雉成功孵化的最佳卵失重范围。

1.3 卵的收集、保存和入孵前的准备

研究期间一共收集了37枚卵进行人工孵化，其中仅有17枚受精卵，其中，2018年8枚，2019年9枚。对卵进行编号、测量，保存在17~21 ℃、相对湿度50%~60%的室内，垂直放置在已消毒的蛋托盘上，保存时间不超过24 h。卵的入孵在每天13: 00。入孵前对卵表面进行清洁，清洁后的卵放入事先调试好的预热箱中预热2~3 h，预热箱30~35 ℃，相对湿度50%，然后转入孵化机内孵化。

1.4 孵化设备和方法

孵化设备有孵化机、出雏机(8015 Compact MP GTFS 84型，Grumbach)、预热机(8104 BSS MP GTFS 160型，Grumbach)、电子天平(精确度0.000 1 g)、除湿机(MD-150E，美菱)。

孵化机分别命名为主孵化机、1号和2号孵化机。孵化温度均设定为37.5 ℃；孵化湿度分别设定为：主孵化机50%~55%，1号和2号孵化机分别为30%和80%。卵侧放在蛋架上，自动翻卵设置为：每2 h 1次，每次30 min，翻动180°。5枚卵孵化失败，因此将12枚卵分为2组，梯度湿度组的6枚卵先放在主孵化机中孵化，在孵化过程中以15%卵失重率计算值和曲线作为标准，比较每天卵的质量变化，用主孵化机、1号和2号孵化机孵化：在每次称量卵质量后计算出卵的实际质量损失，如果卵每日质量损失大于15%失重率理论计算值，就将卵转移到2号孵化机中，若实际质量损失小于理论计算值，则将卵转移到1号孵化机中，当实际质量损失趋于或与理论计算值相符，则移回或仍在主孵化机中继续孵化；均衡湿度组的6枚卵一直在主孵化机中孵化。

孵化期间，每日13: 00称量卵质量。孵化7 d后使用照蛋器验卵，每2 d 1次，肉眼观察并记录胚胎发育情况。称量和验卵过程一般不超过1 min。晾卵随每天称重或验卵进行，时间一般为5~10 min。卵孵化26 d左右，胚胎喙进入气室后，卵被转入出雏机中直到雏鸟出壳，出雏机温度设定为36.5 ℃，湿度70%~80%。原则上胚胎啄壳48 h后不能自行出壳时进行人工辅助出壳。

1.5 数据采集和分析

孵化过程中采集和记录：卵指数(长径、短径、卵质量)、开始孵化日期、出壳日期、啄壳时间、是否进行人工辅助出壳等，并记录每次验卵情况。使用Excel 2013对数据进行计算和分析，绘制卵失重曲线；采用配对样本的 t检验对梯度湿度组和均衡湿度组卵的胚胎的啄壳时间、卵孵化期、卵的失重率和初始雏重数据进行差异性分析；用一元线性回归进行2组卵失重率与初始雏重之间的相关性分析，以及卵平均质量与孵化天数之间的相关性分析。所有数据均在SPSS中进行分析。

2 结果 2.1 卵质量比较

卵呈卵圆形，卵壳呈暗棕黄色或土黄色，具有大小不同的紫褐色斑点。将37枚卵的卵指数与前人研究(李福来等，1985；Kuehler & Lieberman，1989；程彩云等，1993；陶玉静，陈辉，1999)、野外记录(卢汰春等，1986；He et al., 1988)进行了比较(表 1)，其中有3枚卵由于破损，缺少数据。

2.2 孵化数据统计

17枚受精卵中有5枚卵孵化失败，卵的孵化率为70.6%。12只雏鸟3个月内的成活率为100%。12枚卵的啄壳时间最早出现在第26.1天，最晚为第28.3天，平均为(27.4±0.6) d。雏鸟从啄壳到完全出壳的时间最短为36.5 h，最长为58.5 h，平均为(48.7±6.8) h。孵化期最短为28.1 d，最长为30.2 d，平均为(29.5±0.6) d；自然出壳的有4枚，自然出壳率为33%；失重率最小为10.7%，最大为17.6%，平均为14.0%±2.0%(表 2，图 1)。

孵化期间，卵质量(y)与孵化天数(x)呈极显著负相关关系：y=-0.414 8x+82.882 0(r²=0.999 6，P < 0.01)(图 2)。

2.3 不同湿度对孵化的影响

梯度湿度组和均衡湿度组在胚胎啄壳时间和卵孵化期的差异无统计学意义；而在卵的失重率(P=0.034)和初始雏重(P=0.015)的差异有统计学意义。卵失重率与初始雏重之间存在极显著负相关性关系(r=-0.797，P=0.002)。

2.4 胚胎发育过程概述

通过验卵对12枚卵的胚胎发育进行观察和记录。参照家鸡卵胚胎发育特征描述(钟兆红，罗明玉，2011)，不同时期绿尾虹雉卵胚胎发育特征概括如下：

第1天：卵黄表面有1个颜色较深、周围稍亮的圆点。

第7天：卵黄表面可见明显的“蜘蛛状血管”。

第8天：胚胎边缘出现许多红点。

第9天：卵黄囊血管区形状似樱桃。

第10天：卵黄囊血管区形状像蚊子。

第11天：转动卵时卵黄不易跟随转动，舌开始形成，机体的器官均形成。

第12天：可见黑色的眼点，可分辨出雌雄性腺，心脏完全形成。

第13天：胚胎形状像“电话筒”，一端是头部，一端是躯干部，可见胚胎有规律运动，喙和卵齿开始形成。

第14天：胚胎沉在羊水中。

第17天：尿囊血管在卵小头合拢，除气室外，整个卵都布满了血管，胚胎腿上的鳞片和脚趾开始形成。

第24天：以小头对准光源，已看不到发亮的部分，肺血管形成，但无血液循环。

第25天：气室向一侧倾斜，胚胎眼睛开始睁开，转身，喙朝向气室。

第27~28天：卵黄囊全部被吸入腹腔内，喙刺破壳膜，深入气室内，肺呼吸开始，随后啄壳。

第29~30天：听见叫声，胚胎绕卵壳继续啄壳1圈，雏鸟破壳而出。

3 讨论 3.1 卵失重范围

在卵孵化开始设定湿度时，如果不确定，可以从相对湿度55%开始(Brown & Robbins，2002；张敬等，2019b)。对于一些雉类卵来说，从孵化开始到胚胎喙进入气室之前这段时间，可以维持这个湿度；但对于一些特定物种或特殊卵，如厚壳卵或卵壳孔隙度低的卵，要达到理想的卵失重率，实际孵化时采用的湿度可能会有很大差异(Brown & Robbins，2002；张敬等，2019b)。在人工孵化时应该为特定物种或某些特殊卵壳的卵提供不同的孵化湿度，以保证卵达到理想的失重率。通过查阅文献，本研究为绿尾虹雉卵提供了高低不同的梯度式孵化湿度，在一定范围内对卵的失重进行了控制，2018—2019年成功孵化的12枚卵的平均卵失重率为14.0%。综上所述，绿尾虹雉卵在人工孵化时可保持卵失重率在10%~15%，使失重趋近于12%。

3.2 不同孵化方法对雏鸟出壳时间的影响

梯度湿度组和均衡湿度组的差异性分析结果显示，绿尾虹雉卵失重率越小，雏鸟初生质量越大，这必定影响出壳期间胚胎在卵壳内的旋转和破壳的进程，从而对雏鸟的出壳时间产生较大影响，但在孵化末期，卵壳内胚胎的喙顶破卵胎膜进入气室的时间较难观察记录，雏鸟完全出壳的时间也有可能记录不够精确，而影响最后的分析结果，所以本研究没有涉及2组的出壳时间的差异性分析，这有待在今后的孵化试验中进行比较和验证。

致谢: 世界雉类协会专家Richard Edgell、David Rimlinger、Laurent Fontaine、Alain Hennache和Bernard Giboin；北京师范大学生命科学学院张正旺、王鹏程为项目的研究、方法和数据分析提供了帮助；四川宝兴蜂桶寨国家级自然保护区管理局杨玉君、左琳为项目开展提供了支持，侯艳、陈黎参与了项目工作；北京大兴濒危动物驯养繁殖中心程彩云、陶玉静，北京动物园孟彤提供了孵化技术经验；北京动物园重点实验室贾婷、由玉岩为项目提供了帮助，谨此一并致谢。