钠尿肽家族(natriuretic peptide system，NPs)是一类重要多肽家族，可参与调节神经传递、神经调节、免疫和生长等多种生理过程(Toop & Donald，2004)，以及维持机体渗透稳态和心血管稳态。NPs由心房钠尿肽(atrial natriuretic peptide，ANP)、脑钠尿肽(brain natriuretic peptide，BNP)和C-型钠尿肽(C-type natriuretic peptide，CNP)3种结构相关多肽组成(Martinez-Rumayor et al., 2008；Nobata et al., 2010)。ANP和BNP主要在心肌细胞中合成，分泌进入血液循环发挥作用；而CNP则作为旁分泌或自分泌因子合成于大脑或其他外周组织，且具有远弱于ANP和BNP的利尿利钠作用(Takei，2000)。在哺乳动物中，CNP的生理功能包括调节长骨生长、促进软骨内骨化以及作用于血管平滑肌细胞发挥血管舒张作用等(Potter et al., 2006；Johnson & Olson，2008)；此外，CNP可以作用于垂体细胞，促进胞内环磷酸腺苷(cGMP)的积累，抑制促性腺激素释放激素(GnRH)诱导的钙动员，抑制促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)诱导的促肾上腺皮质激素(ACTH)释放等(Fowkes et al., 1999；Fowkes et al., 2000；Chatelain et al., 2003)。

NPs的生理功能依赖其特异性钠尿肽受体(natriuretic peptide receptors，NPRs)发挥效应。在哺乳动物中，NPRs可分为NPR-A、NPR-B和NPR-C 3种类型(Potter et al., 2006)。其中，不同于NPR-A(能够结合ANP和BNP)和NPR-C(能够结合3种类型的NPs)，NPR-B只能选择性地结合CNP，并介导其生理功能，如，CNP或NPR-B敲除型小鼠由于软骨骨化功能受损，会表现出严重的侏儒症表型(Chusho et al., 2001；Tamura et al., 2004；Tsuji & Kunieda，2005)。NPR-B为单次跨膜受体，与NPR-A和NPR-C的氨基酸序列同源性分别为44%和30%，其N端的433个氨基酸位于细胞膜外，最初的22个氨基酸为信号肽序列。此外，N端还包含与CNP结合的重要位点Glu³³²以及参与形成3对二硫键的6个Cys残基和7个N糖基化位点(Ogawa et al., 2004)。C末端的252个氨基酸为鸟苷酸环化酶区域，该区域被认为具有鸟苷酸环化酶活性(Beavo & Brunton，2002)，可以通过产生胞内第二信使cGMP从而介导CNP的生理效应(Pandey，2005；Sabbatini et al., 2005；Kobayashi et al., 2012)。

尽管在哺乳动物中，NPR-B的结构及其介导的生理功能已逐步明确，但在禽类中，有关NPR-B的研究几属空白。鉴于NPR-B介导的软骨骨化和垂体激素释放等生理功能与经济效益密切相关，本研究选择家鸡Gallus gallus domesticus为模型，首次从垂体组织中克隆得到了家鸡NPR-B基因，确定其氨基酸序列，在此基础上，利用实时荧光定量PCR(qPCR)技术首次探究NPR-B基因在成年家鸡中的组织表达图谱。本研究为探究家鸡NPR-B的胞内信号通路及其在家鸡中介导的生理功能奠定基础。

1 材料与方法 1.1 材料

实验动物为罗曼粉成年家鸡，购自四川牧星养鸡场，共选取成年家鸡6只(3雄3雌)；真核表达载体pcDNA3.1(+)购自Invitrogen；引物合成、DNA测序工作由成都擎科梓熙生物技术有限公司完成；RNAzol购自Molecular Research Center；KOD FX高保真DNA聚合酶购自TOYOBO；MMLV逆转录酶、dNTP、Easy-Taq酶、限制性内切酶和T₄ DNA连接酶均购自TaKaRa；分子克隆宿主大肠杆菌Escherichia coli DH5α感受态细胞由本实验室制备保存；PCR仪(S1000 Thermal Cycler)、荧光定量PCR仪(CFX96)、荧光染料Eva Green、96孔板、塑料封膜均购自Bio-Rad。

1.2 方法 1.2.1 总RNA提取

取家鸡组织，包括全脑、心脏、肾脏、肝脏、肌肉、卵巢、精巢、十二指肠、垂体、脾脏、脂肪、端脑、中脑、小脑、后脑和下丘脑等，迅速放入液氮并充分研磨成粉末。总RNA提取严格按照说明书操作:取约60 mg组织粉末与600 μL RNAzol混合；补充240 μL焦碳酸二乙酯(DEPC)灭菌水，用涡旋仪混匀约15 s；4 ℃、12 000 r·min^-1离心15 min；取上清，加入3 μL阿司咪唑，涡旋15 s后于4 ℃、12 000 r·min^-1离心10 min；取上清，加入等体积异丙醇，于4 ℃、12 000 r·min^-1离心10 min；小心吸取上清并弃掉，加入75%乙醇漂洗总RNA沉淀，于4 ℃、8 000 r·min^-1离心3 min；重复上一步，漂洗RNA沉淀；弃上清，用20 μL DEPC灭菌水溶解沉淀，及时构建cDNA模板或-80 ℃保存。

1.2.2 引物设计

利用NCBI预测的家鸡NPR-B基因序列(GenBank登录号:XM_003642919)和家鸡的野生祖先红原鸡Gallus gallus基因组数据库信息(http://www.ensembl.org/Gallus_gallus)，依据引物设计原则设计克隆家鸡NPR-B基因的编码区全长克隆引物和用于组织表达分析的qPCR引物(表 1)。

1.2.3 cDNA模板制备

以各组织总RNA为模板进行逆转录构建cDNA模板。取2 μg总RNA样品，与1 μL Oligo-dT混合；补DEPC灭菌水至总体积5 μL(Oligo-dT终浓度为0.5 μg·μL^-1)，混匀；于PCR仪中70 ℃反应10 min后，立即取出放置于冰上10 min；加入2 μL5×RT buffer，0.5 μL MMLV逆转录酶，0.5 μL dNTPs，补充DEPC灭菌水至总体积10 μL，混匀后于PCR仪中42 ℃反应1.5 h，70 ℃反应10 min结束；取反应所得产物加入70 μL灭菌水，所得混合溶液即为cDNA模板。

1.2.4 载体构建

以家鸡垂体组织cDNA为模板，使用引物对NPR-B基因的开放阅读框(ORF)进行扩增。PCR扩增体系:5 μL 2×KOD缓冲液，2 μL垂体组织cDNA模板，2 μL dNTPs，上、下游引物各0.1 μL，0.5 μL KOD-FX聚合酶，0.3 μL去离子灭菌水。PCR扩增条件:94 ℃预变性2 min；98 ℃变性10 s，62 ℃退火30 s，68 ℃延伸3 min，34个循环；68 ℃延伸10 min。取3 μL反应产物，用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果。利用DNA纯化回收试剂盒回收PCR反应液，使用EcoR I 和Hind III 对pcDNA3.1质粒和纯化回收产物进行酶切，37 ℃过夜；纯化回收酶切产物，使用T₄ DNA连接酶连接的pcDNA3.1和NPR-B片段；按常规方法转化感受态细胞，再涂于含氨苄青霉素、IPTG和X-Gal的LB培养基上37 ℃过夜培养，挑选阳性单克隆提取质粒，送成都擎科梓熙生物技术有限公司测序。

1.2.5 组织表达分析

采用家鸡不同组织的cDNA模板，3只公鸡为雄性组，3只母鸡为雌性组，以qPCR方法检测NPR-B基因的表达水平，具体方法参考祝国强等(2017)和邓秋洋等(2018)。PCR扩增体系:0.4 μL二甲亚砜，2 μL 10×buffer，6 μL cDNA模板，0.4 μL dNTPs，上、下游引物各0.2 μL，1 μL荧光染料Eva Green，1 μL Easy-Taq酶，最后用去离子灭菌水补足总体积至20 μL。PCR扩增条件:94 ℃预变性2 min；94 ℃变性20 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s，39个循环，按照0.5 ℃/5 s的速度从70 ℃到95 ℃向上升温熔解，生成熔解曲线。荧光定量PCR的结果按照比较CT值法(2^－ΔΔCT法)进行相对表达量数据处理。

1.2.6 生物信息学分析

使用SnapGene、DNAStar和APE进行序列分析和蛋白质翻译，IBS 1.0绘制基因结构图，BioEdit和DNAMAN进行DNA和蛋白质序列比对，CFX Manager进行qPCR数据定量分析；序列分析使用的在线数据库包括GenBank(http://www.ncbi.nih.gov)、Ensembl(http://www.ensembl.org)和TMHMM 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)。

1.2.7 数据统计与分析

实验数据用Graphpad Prism7进行分析，数据用平均值±标准差(Mean±SD)表示，相同组织在雄性组和雌性组之间的比较用t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果 2.1 家鸡NPR-B基因的克隆与序列分析

实验成功扩增得到与预期大小一致的NPR-B基因条带(图 1)。将家鸡NPR-B基因的测序结果与红原鸡基因组序列进行比对，结果显示:家鸡NPR-B基因位于Z染色体上，包含22个外显子(图 2)，编码区cDNA全长3 189 bp，编码1 062个氨基酸(GenBank登录号:MH271322)。家鸡的NPR-B与人Homo sapiens、大鼠Rattus norvegicus、非洲爪蟾Xenopus laevis和斑马鱼Danio rerio相比，氨基酸序列一致性分别达到了79%、78%、73%和67%。胞内区(intracellular domain，ICD)存在高度保守的结构域，包括无激酶活性的激酶同源区(kinase homology domain，KHD)和鸟苷酸环化酶区(guanylyl cyclase domain，GCD)，且KHD中存在NPR-A和NPR-B均具有的保守的ATP结合元件Gly-X-X-X-Gly序列(图 3)。

2.2 家鸡NPR-B基因mRNA组织表达分析

在外周组织中，NPR-B基因高表达于心脏、肌肉、肾脏和垂体，而在精巢、十二指肠的表达量相对较低，在脂肪、脾脏检测到微弱的表达信号；在中枢神经系统中，NPR-B基因高表达于中脑，在其他脑功能区的表达水平较低。

NPR-B基因位于家鸡Z染色体上，因此，基因组中雄、雌性的NPR-B基因拷贝数比例为2: 1。比较不同性别组中NPR-B基因的组织表达情况(图 4:A)，结果显示，雄性个体NPR-B基因在端脑和小脑中具有更高的表达水平，而雌性个体NPR-B基因在心脏、肾脏和垂体组织中具有更高的表达水平。

NPR-B基因在垂体中具有较高的表达水平，检测其在垂体头部和尾部的表达，结果显示，NPR-B基因特异性高表达于垂体头部(图 4:B)。

3 讨论

在哺乳动物中，CNP作为旁分泌或自分泌因子，通过激活NPR-B参与调节神经系统功能、血管张力、成骨细胞分裂分化以及软骨骨化等功能(Potter et al., 2006)，但其在禽类中的研究十分欠缺。本研究从家鸡垂体组织中克隆得到NPR-B基因，并首次报道其序列和组织表达图谱，研究结果为探究NPR-B受体及其配体CNP在家鸡中的生理功能奠定基础。

家鸡NPR-B基因的cDNA序列全长3 189 bp，由22个外显子组成，编码具1 062个氨基酸的蛋白。氨基酸序列比对显示，家鸡NPR-B与人、大鼠、非洲爪蟾和斑马鱼均具有较高的序列一致性，尤其是ICD的氨基酸序列高度保守，该区域包含的位点有助于NPR-B二聚化及结合配体后的空间构象改变。在受体激活后，ATP将结合到胞内KHD上的ATP结合位点，活化的KHD进一步激活下方的鸟苷酸环化酶，从而催化胞内cGMP的生成(Joubert et al., 2005)，这预示着NPR-B在家鸡中具有与哺乳动物类似的信号通路。

本研究利用qPCR解析NPR-B基因在家鸡组织中的表达。结果显示，NPR-B基因在家鸡心脏、肾脏、肌肉、中脑和垂体中有较高表达水平，在精巢、十二指肠中表达量相对较低。此外，雌、雄性个体相同组织间NPR-B基因的表达水平有差异，这种差异是否与NPR-B基因位于Z染色体有关有待后续研究。NPR-B基因在心脏中的高表达预示其可能参与CNP调节血管张力的生理功能(Toop & Donald，2004)；其在脑和垂体中的高表达与大鼠中的研究结果高度一致(Langub et al., 1995)，暗示NPR-B在脑和垂体中具有保守的生理功能。同时，进一步检测了NPR-B基因在家鸡垂体头部和尾部的表达差异，发现NPR-B基因特异性高表达于家鸡垂体头部区域，该区域垂体细胞主要分泌2种关键垂体激素:ACTH和催乳素。在小鼠中的研究发现，CNP在生理浓度下可以抑制由CRH引起的垂体ACTH释放(Guild & Cramb，1999)，结合NPR-B在家鸡垂体头部的特异性分布，本研究暗示家鸡CNP/NPR-B系统可能参与调控家鸡垂体激素(ACTH或催乳素)的释放，进而影响家鸡应激或繁殖，值得深入探究。