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文章信息
- 郝艳芹, 周闯, 晋家正, 沈咏梅, 张修月, 岳碧松
- HAO Yanqin, ZHOU Chuang, JIN Jiazheng, SHEN Yongmei, ZHANG Xiuyue, YUE Bisong
- 美洲大蠊成虫肠道菌群多样性分析
- Analysis on the Intestinal Microbiota Diversity of Adult Periplaneta americana
- 四川动物, 2018, 37(4): 415-419
- Sichuan Journal of Zoology, 2018, 37(4): 415-419
- 10.11984/j.issn.1000-7083.20180081
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文章历史
- 收稿日期: 2018-03-12
- 接受日期: 2018-05-15
2. 药用美洲大蠊四川省重点实验室, 成都 610081
2. Sichuan Key Laboratory of Medicinal American Cockroach, Chengdu 610081, China
宿主肠道中微生物群落与其健康相关,它们能够与宿主相互协作增加机体整体适应性(张振宇等,2017)。肠道菌群能合成胆汁酸、胆碱以及短链脂肪酸等对机体健康有利的代谢产物(Nicholson & Wilson,2003),微生物还能与宿主代谢互作产生维持宿主正常免疫的代谢产物,如小肽、多胺和甲基供体等(Nicholson et al., 2012)。
美洲大蠊Periplaneta americana隶属于蜚蠊目Blattaria蜚蠊科Blattidae大蠊属Periplaneta,杂食特性和超强的环境适应能力使其成为研究宿主与肠道菌群间协同进化关系的重要模型之一(Mullins,2015)。Ondrejech(2016)以美洲大蠊为模型研究肠道菌群与宿主关系时发现,使用抗生素消除肠道菌群后,宿主的代谢速率减缓且体质量降低,表明肠道菌群可能为宿主提供必要的营养物质。Sabree等(2009)在构建美洲大蠊的内共生菌——蟑螂杆状体属Blattabacterium的消化通路时,发现内共生菌能为宿主提供自身不能合成的氨基酸和维生素等,以提高宿主对营养不均衡食物的利用率。美洲大蠊肠道菌群具有高度多样性的特征,刘晓飞等(2015)采用体外培养从美洲大蠊成虫肠道中分离出20种细菌,它们多数属于变形杆菌门Proteobacteria和拟杆菌门Bacteroidetes这两大类昆虫肠道优势菌门。Bagde等(2013)在研究美洲大蠊成虫肠道时发现,可培养细菌不仅有芽孢杆菌属Bacillus,还有肠杆菌属Enterobacteria、志贺氏杆菌Shigas basillus等机会致病菌,还有伤寒沙门氏菌Salmonella typhi等致病菌。这些研究多集中在肠道菌群功能及它们是否能体外培养等方面,对美洲大蠊成虫肠道菌群结构的研究较为缺乏。本研究采用16S rRNA高通量测序技术研究美洲大蠊成虫肠道菌群多样性,避免遗漏体外不能分离培养的细菌,以期鉴定出更全面的美洲大蠊肠道菌群群落,深入研究肠道菌群与宿主相互关系。
1 实验方法 1.1 实验材料实验采用的美洲大蠊成虫来源于四川好医生攀西药业有限责任公司美洲大蠊养殖基地。随机选取6只成虫,饥饿24 h,在无菌室用75%乙醇表面消毒30 s,再用无菌水漂洗3次。剪去虫体的翅膀和腿,用大头针固定头部,从背面中部的肛门开始剪开,直到头部。将整个肠道移到2 mL EP管中,-80 ℃保存(Carrasco et al., 2014)。
1.2 总DNA提取和PCR扩增及测序混合6个肠道样品后用液氮研磨。参考十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法提取总DNA(李钧敏,金则新,2006)。琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度,无菌水稀释样品至1 ng·μL-1。使用16S rRNA V4可变区的通用引物:515F(GTGCCAGC MGCCGCGGTAA)、806R(GGACTACNNGGGTATCTAAT)进行PCR扩增,20 μL体系包括:High-Fidelity PCR Master Mix 10 μL,带Barcode的特异引物各1 μL,高保真酶0.3 μL,模板DNA 1 μL,剩余部分由ddH2O补齐,反应程序为:98 ℃ 1 min;30个循环(98 ℃ 10 s,50 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s);72 ℃ 5 min。产物送北京诺禾致源科技有限公司用HiSeq PE250平台测序。
1.3 数据分析参照Qiime(V1.7.0,http://qiime.org/scripts/split_libraries_fastq.html)的Tags质量控制流程对获得的测序数据进行拼接和过滤处理。将处理后的数据以97%的一致性利用Uparse(Edgar,2013)全部聚类成操作分类单元(OTUs)。同时选取OTUs的代表性序列,使用Mothur(Wang et al., 2007)与SILVA的SSUrRNA数据库(Quast et al., 2013)进行物种注释分析并统计各样本的菌群组成。
2 结果 2.1 肠道菌群门水平上的多样性通过16S rRNA测序检测到细菌序列67 492条,归类为581个OTUs,物种注释到21个门。肠道的优势菌门为厚壁菌门Firmicutes(56.96%)和拟杆菌门(33.13%),其后依次为变形杆菌门(6.65%)、放线菌门Actinobacteria (1.11%)和浮霉菌门Planctomycetes(1.03%)等(表 1)。
分类 Taxonomy |
测序序列数 Number of sequences |
相对丰度 Relative abundance/% |
厚壁菌门Firmicutes | 38 455 | 56.96 |
拟杆菌门Bacteroidetes | 22 436 | 33.13 |
变形杆菌门Proteobacteria | 4 438 | 6.65 |
放线菌门Actinobacteria | 796 | 1.11 |
浮霉菌门Planctomycetes | 697 | 1.03 |
软壁菌门Tenericutes | 251 | 0.41 |
酸杆菌门Acidobacteria | 77 | 0.16 |
广古菌门Euryarchaeota | 53 | 0.07 |
黏胶球形菌门Lentisphaerae | 38 | 0.05 |
脱铁杆菌门Deferribacteres | 27 | 0.05 |
螺旋体门Spirochaetes | 22 | 0.02 |
梭杆菌门Fusobacteria | 19 | 0.02 |
绿弯菌门Chloroflexi | 13 | 0.02 |
疣微菌门Verrucomicrobia | 10 | 0.02 |
蓝细菌Cyanobacteria | 7 | 0.01 |
迷踪菌门Elusimicrobia | 5 | 0.01 |
CKC4 | 3 | <0.01 |
芽单胞菌门Gemmatimonadetes | 2 | <0.01 |
栖热链球菌门Deinococcus-Thermus | 2 | <0.01 |
硝化螺旋菌门Nitrospirae | 1 | <0.01 |
RsaHF231 | 1 | <0.01 |
注:相对丰度=物种有效序列数/样本总有效序列数;下同 Note:Relative abundance=number of valid sequences of the species/ number of total valid sequencesl;the same below |
从目水平上对美洲大蠊成虫肠道菌群组成进行分析发现,相对丰度≥0.1%的目占总目数的18.99%(15/79)。优势菌目主要为拟杆菌目Bacteroidales(32.11%)、芽孢杆菌目Bacillales(29.89%)、梭菌目Clostridiales(12.93%)和乳杆菌目Lactobacillales(10.73%)(表 2)。
目 Order |
测序序列数 Number of sequences |
相对丰度 Relative abundance/% |
拟杆菌目Bacteroidales | 21 748 | 32.11 |
芽孢杆菌目Bacillales | 20 191 | 29.89 |
梭菌目Clostridiales | 8 666 | 12.93 |
乳杆菌目Lactobacillales | 7 300 | 10.73 |
丹毒丝菌目Erysipelotrichales | 2 467 | 3.07 |
假单胞菌目Pseudomonadales | 2 053 | 1.70 |
脱硫菌目Desulfobacterales | 1 145 | 1.17 |
微球菌目Micrococcales | 784 | 1.07 |
脱硫弧菌目Desulfovibrionales | 728 | 0.98 |
肠杆菌目Enterobacteriales | 643 | 0.84 |
Rs-K70_termite_group | 550 | 0.28 |
Selenomonadales | 185 | 0.24 |
Mollicutes_RF9 | 168 | 0.21 |
Acholeplasmatales | 129 | 0.18 |
海洋螺菌目Oceanospirillales | 116 | 0.12 |
对样品检测到的所有OTUs序列进行聚类注释后得到193个属,其中相对丰度≥0.1%的菌属有39个。除变形杆菌门的脱硫弧菌属Desulfovibrio(0.94%)等6个属、放线菌门的微球菌属Micrococcus(1.00%)和软壁菌门Tenericutes的无胆甾原体属Acholeplasma(0.18%)外,其余31属均属于厚壁菌门和拟杆菌门这两大优势菌门。厚壁菌门中的优势菌属分别为葡萄球菌属Staphylococcus(16.59%)、芽孢杆菌属Bacillus(13.26%)和Lactobacillus(8.92%);拟杆菌门中的优势菌属为副杆菌属Parabacteroides(10.26%)(表 3)。
优势菌门 Dominant phylum |
属 Genus |
相对丰度 Relative abundance/% |
厚壁菌门 Firmicutes |
葡萄球菌属Staphylococcus | 16.59 |
芽孢杆菌属Bacillus | 13.26 | |
Lactobacillus | 8.92 | |
Christensenellaceae R-7_group | 2.29 | |
链球菌属Streptococcus | 0.97 | |
Erysipelatoclostridium | 0.53 | |
劳特氏菌属Blautia | 0.49 | |
乳球菌属Lactococcus | 0.48 | |
Anaerotruncus | 0.40 | |
Erysipelotrichaceae UCG-001 | 0.39 | |
罕见小球菌属Subdoligranulum | 0.29 | |
Ruminococcaceae UCG-014 | 0.25 | |
Catenibacterium | 0.22 | |
Clostridium sensu stricto 1 | 0.19 | |
Candidatus soleaferrea | 0.17 | |
肉食杆菌属Carnobacterium | 0.16 | |
Holdemanella | 0.16 | |
Ruminiclostridium 9 | 0.14 | |
Eubacterium coprostanoligenes group | 0.12 | |
Ruminococcus gauvreauii group | 0.12 | |
Lachnoclostridium | 0.10 | |
Eubacterium hallii group | 0.10 | |
Coprococcus 3 | 0.10 | |
拟杆菌门 Bacteroidetes |
副杆菌属Parabacteroides | 10.26 |
类杆菌属Bacteroides | 3.29 | |
Dysgonomonas | 2.46 | |
另枝菌属Alistipes | 1.77 | |
Candidatus symbiothrix | 0.70 | |
Tannerella | 0.62 | |
Paludibacter | 0.16 | |
Prevotella 9 | 0.12 | |
变形杆菌门 Proteobacteria |
脱硫弧菌属Desulfovibrio | 0.94 |
冷杆菌属Psychrobacter | 0.92 | |
假单胞菌属Pseudomonas | 0.72 | |
脱硫球茎菌属Desulfobulbus | 0.57 | |
Desulfatiferula | 0.19 | |
盐单胞菌属Halomonas | 0.12 | |
放线菌门 Actinobacteria |
微球菌属Micrococcus | 1.00 |
软壁菌门 Tenericutes |
无胆甾原体属Acholeplasma | 0.18 |
在美洲大蠊成虫肠道菌群中,共注释到83种细菌,但由于测序片段较短,数据并不可信。统计美洲大蠊排名前5的优势菌属中注释到的菌种,葡萄球菌属中注释到的松鼠葡萄球菌Staphylococcus sciuri(14.95%)是美洲大蠊成虫肠道中的优势菌种。副杆菌属中注释到的菌种为Parabacteroides merdae。Lactobacillus中注释到的菌种为加氏乳杆菌L. gasseri、戊糖乳杆菌L. pentosus、粘膜乳杆菌L. mucosae和动物乳杆菌L. animalis(表 4)。
优势菌属 Dominant genus |
种名 Species |
相对丰度 Relative abundance/% |
葡萄球菌属 Staphylococcus |
松鼠葡萄球菌S. sciuri | 14.95 |
副杆菌属 Parabacteroides |
P. merdae | 0.02 |
Lactobacillus | 加氏乳杆菌L. gasseri | 1.03 |
戊糖乳杆菌L. pentosus | 0.29 | |
粘膜乳杆菌L. mucosae | 0.11 | |
动物乳杆菌L. animalis | 0.04 |
美洲大蠊成虫肠道菌群与其他昆虫具有一定的相似性,以厚壁菌门、拟杆菌门为主要优势类群(Sabree & Moran,2014;Douglas,2015),这2个菌门中的许多种类能够消化纤维素、碳水化合物和蛋白质等。例如,厚壁菌门的优势菌属芽孢杆菌属和Lactobacillus为发酵类细菌,它们不仅能够利用碳水化合物生成乳酸,促进营养物质的吸收,还可以产生细菌素等物质抵抗真菌的侵害(Inglin et al., 2015);拟杆菌门类杆菌属Bacteroides的大部分细菌拥有水解多糖的酶,能够把复杂的多糖转变成简单的可供宿主利用的营养物质(Xu et al., 2007)。除此之外,有研究发现变形杆菌门的优势菌属脱硫弧菌属是存在于人体肠道内常见的条件致病菌,它们在无氧条件下可将硫酸盐还原为对肠道上皮细胞具有毒性作用的硫化物,还可诱导上皮细胞的异常增殖,造成非炎症性肠病等(Loubinoux et al., 2002),而其在美洲大蠊肠道中的作用有待进一步研究。放线菌门的许多种类能够参与宿主的碳氮循环和抵抗病菌侵染(Flint,2011;张晓杰等,2016)。这些主要优势菌门和其他一些菌属的存在为美洲大蠊的生长、发育和繁殖提供了有利的保障。
Bertino-Grimaldi等(2013)对美洲大蠊成虫肠道菌群研究时发现,其优势菌门为拟杆菌门和变形杆菌门,这与本研究结果差异较大。这种差异的产生可能与美洲大蠊的来源有关,本研究检测的是人工饲养种群,而Bertino-Grimaldi等(2013)检测的是野生种群。研究表明,美洲大蠊肠道微生物能够随着宿主饮食的改变而改变,当它取食高纤维食料时,厚壁菌门显著增加(Danielle et al., 2013),取食高蛋白食料时肠道菌群的丰富性增加(Pérezcobas et al., 2015)。本实验所采用的样本为人工饲养种群,其生存条件和摄取的营养物质与生活在环境较为恶劣的下水道等地的野生种群有很大差异,所以与其他研究结果中优势菌门不一致是合理的。由于16S rRNA高通量测序片段较短,许多序列并不能注释到种,注释到种的结果可信度也不高。因此,只对排名前5的优势菌属中注释到的细菌进行了统计。结果发现,优势菌种为葡萄球菌属的松鼠葡萄球菌,它是一种常见的动物病原菌,不但能引起黄鳝Monopterus albus、黄喉拟水龟Mauremys mutica等动物感染,还能引起人脑膜炎、尿路等感染(段荟芹,王利,2015),但它是否会引起人工饲养的美洲大蠊患病尚无研究。Lactobacillus中的戊糖乳杆菌在人类肠道中占优势,能够帮助宿主降解肉类食物,同时还能够通过产生过氧化氢来帮助宿主抵抗致病菌的侵染(Tailliez,2004)。据此推测,它可能为美洲大蠊肠道中的益生菌,但其具体功能有待进一步研究。
本研究发现,美洲大蠊肠道菌群种类丰富,这可能与美洲大蠊适应性强、生存力强、食性杂有关。本研究为美洲大蠊与其肠道菌群之间的关系研究提供一定的理论参考,也为美洲大蠊的健康养殖提供了新思路。
段荟芹, 王利. 2015. 耗儿鱼松鼠葡萄球菌的分离鉴定及耐药性分析[J]. 中国畜牧兽医, 42(5): 1288–1293. |
李钧敏, 金则新. 2006. 一种高效可直接用于PCR分析的土壤总微生物DNA抽提方法[J]. 应用生态学报, 17(11): 2107–2111. DOI:10.3321/j.issn:1001-9332.2006.11.022 |
刘晓飞, 刘娟, 田蕾, 等. 2015. 美洲大蠊成虫肠道可培养细菌多样性研究[J]. 微生物学通报, 42(11): 2207–2214. |
张晓杰, 莫晓畅, 莫建初. 2016. 白蚁共生放线菌研究进展[J]. 环境昆虫学报, 38(2): 437–444. |
张振宇, 圣平, 黄胜威, 等. 2017. 昆虫肠道菌群的多样性、功能及应用[J]. 氨基酸和生物资源, 39(4): 231–239. |
Bagde US, Uma G, Ram P. 2013. Isolation and characterization of gut-associated microbes in cockroach[J]. African Journal of Microbiology Research, 7(19): 2034–2039. DOI:10.5897/AJMR |
Bertino-Grimaldi D, Medeiros MN, Vieira RP, et al. 2013. Bacterial community composition shifts in the gut of Periplaneta americana, fed on different lignocellulosic materials[J]. SpringerPlus, 2: 609. DOI:10.1186/2193-1801-2-609 |
Carrasco P, Pérez-Cobas AE, van de PC. 2014. Succession of the gut microbiota in the cockroach Blattella germanica[J]. International Microbiology, 17(2): 99–109. |
Douglas AE. 2015. Multiorganismal insects:diversity and function of resident microorganisms[J]. Annual Review of Entomology, 60(1): 17–34. DOI:10.1146/annurev-ento-010814-020822 |
Edgar RC. 2013. UPARSE:highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads[J]. Nature Methods, 10(10): 996–998. DOI:10.1038/nmeth.2604 |
Flint H. 2011. Obesity and the gut microbiota[J]. Journal of Clinical Gastroenterology, 45: S128–S132. DOI:10.1097/MCG.0b013e31821f44c4 |
Inglin R, Stevens M, Meile L, et al. 2015. High-throughput screening assays for antibacterial and antifungal activities of Lactobacillus species[J]. Journal of Microbiological Methods, 114: 26–29. DOI:10.1016/j.mimet.2015.04.011 |
Loubinoux J, Bronowicki J, Pereira IAC. 2002. Sulfate-reducing bacteria in human feces and their association with inflammatory bowel diseases[J]. FEMS Microbiology Ecology, 40(2): 107–112. DOI:10.1111/fem.2002.40.issue-2 |
Mullins D. 2015. Physiology of environmental adaptations and resource acquisition in cockroaches[J]. Annual Review of Entomology, 60: 473–492. DOI:10.1146/annurev-ento-011613-162036 |
Nicholson JK, Holmes E, Kinross J, et al. 2012. Host-gut microbiota metabolic interactions[J]. Science, 336(6086): 1262–1267. DOI:10.1126/science.1223813 |
Nicholson JK, Wilson ID. 2003. Opinion:understanding 'global' systems biology:metabonomics and the continuum of metabolism[J]. Nature Reviews Drug Discovery, 2(8): 668–676. DOI:10.1038/nrd1157 |
Ondrejech A. 2016. Effect of diet and bacterial clearance on energy expenditure in the cockroach Periplaneta americana[R]. Columbus: The Ohio State University Denman Undergraduate Research Forum. |
Pérezcobas AE, Maiques E, Angelova A, et al. 2015. Diet shapes the gut microbiota of the omnivorous cockroach Blattella germanica[J]. FEMS Microbiology Ecology, 91(4). DOI:10.1093/femsec/fiv022 |
Quast C, Pruesse E, Yilmaz P, et al. 2013. The SILVA ribosomal RNA gene database project:improved data processing and web-based tools[J]. Nucleic Acids Research, 41(Database issue): 590–596. |
Sabree ZL, Kambhampati S, Moran NA. 2009. Nitrogen recycling and nutritional provisioning by Blattabacterium, the cockroach endosymbiont[J]. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America, 106(46): 19521–19526. DOI:10.1073/pnas.0907504106 |
Sabree ZL, Moran NA. 2014. Host-specific assemblages typify gut microbial communities of related insect species[J]. SpringerPlus, 3(1): 138. DOI:10.1186/2193-1801-3-138 |
Tailliez P. 2004. Lactobacilli:properties, habitats, physiological role and importance in human health[J]. Antibiotiques, 6(1): 35–41. DOI:10.1016/S1294-5501(04)94231-8 |
Wang Q, Garrity GM, Tiedje JM, et al. 2007. Naive bayesian classifier for rapid assignment of rRNA sequences into the new bacterial taxonomy[J]. Applied & Environmental Microbiology, 73(16): 5261–5267. |
Xu J, Mahowald MA, Ley RE, et al. 2007. Evolution of symbiotic bacteria in the distal human intestine[J]. PLoS Biology, 5(7): e156. DOI:10.1371/journal.pbio.0050156 |