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文章信息
- 魏立雯, 袁章琴, 赵明德, 韩建红, 古从伟, 付陆
- WEI Liwen, YUAN Zhangqin, ZHAO Mingde, HAN Jianhong, GU Congwei, FU Lu
- 大麻素受体1对小鼠脂质代谢的作用研究
- Effect of Cannabinoid Receptor 1 on Lipid Metabolism in Diet-induced Obese Mice
- 四川动物, 2018, 37(1): 51-56
- Sichuan Journal of Zoology, 2018, 37(1): 51-56
- 10.11984/j.issn.1000-7083.20170165
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文章历史
- 收稿日期: 2017-05-22
- 接受日期: 2017-10-13
2. 苏州大学附属第一医院骨科研究所, 江苏苏州 215006
2. Department of Orthopaedics, The First Affiliated Hospital, Orthopaedic Institute, Soochow University, Suzhou, Jiangsu Province 215006, China
随着人类生活水平的提高,肥胖已成为全球性的现代文明病,它是目前发病率急剧上升的一种慢性疾病(王瑾等,2016)。肥胖常伴随多种严重并发症,涉及心血管、神经、呼吸、内分泌和消化等多个系统(汤劐菱等,2007)。因此,世界卫生组织已确认肥胖为一种疾病,并向全世界宣布“肥胖症将是全球首要的健康问题”。深入了解脂质代谢的分子机制,对于改善人体健康、靶向调控脂质代谢紊乱及其诱发的其他代谢性疾病,具有非常重要的意义。
大麻素受体(cannabinoid receptor 1,CB1)是内源性大麻素(endogenous cannabinoid,EC)信号系统的主要受体(胡予等,2007),在脂质代谢、胰岛素抵抗及葡萄糖摄取等机制中发挥重要作用,与糖尿病、肥胖以及脂肪沉积密切相关(Howlett et al., 2002;Matias et al., 2006)。利莫那班(SR141716)是CB1受体抑制剂,通过选择性阻断EC信号系统中CB1发挥作用(马微等,2010)。肉碱棕榈酰转移酶1(carnitine palmitoyltransferase-1,CPT1)是脂肪酸β-氧化的关键酶,与脂肪酸分解和体脂含量密切相关(Louet et al., 2001)。CPT1高表达可以促进脂肪酸分解、降低体脂百分比、改善肝脏变性(Musso et al., 2009)。其中,肉碱棕榈酰转移酶1A(CPT1A)主要在肝脏、肾脏和胰腺表达,主要作用是调节脂肪酸β-氧化、促进脂肪生成,其表达量降低会导致线粒体功能障碍、脂肪肝和肥胖(Drynan et al., 1996;Amengual et al., 2012)。肉碱棕榈酰转移酶1B(CPT1B)主要在心脏和脂肪组织表达,低表达时引起心脏功能障碍、白色脂肪组织的脂肪沉积(He et al., 2012;Ratner et al., 2015)。
本课题组前期的研究表明,在体外细胞中,CB1通过调控CPT1A和CPT1B的表达影响脂质代谢和脂肪沉积(Zhang et al., 2014)。但是,目前还没有实验研究体内CB1通过对CPT1A、CPT1B作用来调节肥胖和脂质代谢的作用。本研究使用高脂饮食喂养小鼠构建肥胖模型,给予SR141716观察CB1对CPT1A、CPT1B表达的影响,为临床上预防代谢紊乱提供新思路。
1 材料与方法 1.1 构建肥胖模型选取70只5周龄健康雄性C57BL/6J小鼠,由成都达硕实验动物有限公司提供,实验动物生产许可证号:SCXK(川)2015-030。饲喂于西南医科大学实验动物中心SPF屏障系统,实验动物使用许可证号:SYXK(川)2013-065,温度20~24 ℃,湿度40%~70%,光照时间为08: 00—20: 00。其中, 20只给予正常标准饲料,另外50只给予高脂饲料,共16周。收集血液测定血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)。根据血清生化指标筛选出30只肥胖模型小鼠。
1.2 药物处理及采样将SR141716溶解在含0.1%Tween-80的蒸馏水中。从标准饲料饲养组中随机选取15只小鼠做空白对照(S-Veh组),随机将30只肥胖模型小鼠分为2组(D-Veh组、D-SR组)。S-Veh组和D-Veh组灌胃0.1%Tween-80,D-SR组灌胃SR141716(10 mg·kg-1·day-1),每日测量小鼠体质量,共3周。灌胃实验结束后,颈椎脱臼处死小鼠,采集血液,用于测定生化指标。分离采集各组织样本,生理盐水冲洗后,称量,待RNA和蛋白质提取用。
1.3 血清生化指标检测运用全自动生化分析仪(ES-480)检测血清中TG、TC、HDL和LDL的含量。使用Multiskan FC酶标仪(Thermo Scientific,USA),按照ELISA试剂盒(Boster,武汉)检测血清脂联素和瘦素含量。
1.4 总RNA提取和cDNA的制备使用RNAsimple Total RNA Kit(TianGen,北京)提取试剂盒,按照说明提取各组织总RNA,并通过A260/A280值和1%琼脂糖凝胶电泳判断所提取的RNA质量。使用PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa,大连)反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA。
1.5 实时荧光定量PCR采用2-△△CT法(Vandesompele et al., 2002)以β-actin和GAPDH作为双内参,在CFX96TMReal-time System上检测CB1、CPT1A和CPT1B基因在各组织中mRNA的表达水平。根据NCBI提供的各基因参考序列,设计荧光定量引物(表 1),由北京六合华大基因有限公司合成。按照SYBR© Premix Ex TaqTM Ⅱ (TaKaRa,大连)试剂盒的使用说明书加样,标准品作为板间对照,并设No-Template Control,每个待测样3个重复。
基因 | 序列5'-3' | 长度/bp | 熔解温度/℃ |
CB1 | F:CGTGCTTACTTAGTTTGCTG R:TTCTATGGGTAGTTAGGCTTC |
171 | 54.0 |
CPT1A | F:CGCCATACTGCTGTATCGTC R:ATGTGCCTGCTGTCCTTGA |
171 | 58.5 |
CPT1B | F:ATGTGCAAGCAGCCCGTCTAG R:TGCCTGGGATGCGTGTAGTG |
159 | 62.0 |
β-actin | F:GTCCCTCACCCTCCCAAAAG R:GCTGCCTCAACACCTCAACCC |
266 | 55.8 |
GAPDH | F:GGTGAAGGTCGGTGTGAACG R:CTCGCTCCTGGAAGATGGTG |
233 | 57.0 |
使用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA蛋白裂解液(Pierce Biotechnology,USA)提取各组织蛋白质。利用BCA Protein Assay Kit(Life Technologies,USA)测定蛋白质含量。CB1单克隆抗体(Beverly,USA)、β-actin(Santa,USA)以及辣根过氧化物酶标记二抗(Boster,武汉)。Western Blot实验的具体操作方法主要参考Fu等(2016)。
1.7 数据处理所有数据以Mean±SE表示,运用SPSS 19.0分析处理,组间的差异比较采用单因素方差分析。显著性水平α=0.05。
2 结果 2.1 小鼠体质量、肝脏质量、血清生化指标的变化在药物处理之前,S-Veh、D-Veh和D-SR各组小鼠的平均体质量分别为30.5 g±0.4 g、40.6 g±0.3 g和41.2 g±0.4 g,统计分析发现S-Veh组与D-Veh组、D-SR组之间差异均有统计学意义(P<0.05),而D-Veh组和D-SR组之间差异无统计学意义(P>0.05)。经过3周SR141716灌胃处理后,各组小鼠的平均体质量分别为28.4 g±0.5 g、36.5 g±0.8 g和30.3 g±1.2 g。与D-Veh组相比,D-SR组小鼠的体质量极显著降低(P<0.01);与D-Veh组相比,D-SR组小鼠的肝脏质量显著降低(P<0.05)(图 1)。同时,血清生化指标分析发现,与D-Veh组相比,D-SR组的TC和瘦素含量显著降低(P<0.05),HDL和脂联素含量显著升高(P<0.05),而TG和LDL含量的差异无统计学意义(P>0.05)(表 2)。
组别 Group |
甘油三酯TG/(mg·dL-1) | 总胆固醇TC/(mg·dL-1) | 高密度脂蛋白HDL/(mg·dL-1) | 低密度脂蛋白LDL/(mg·dL-1) | 脂联素Adiponectin/(μg·mL-1) | 瘦素Leptin/(ng·mL-1) |
S-Veh | 256.3±12.8 | 81.2±4.8 | 48.1±1.5 | 23.6±0.7 | 20.3±0.9 | 6.71±0.48 |
D-Veh | 168.3±8.9 | 135.4±9.5 | 37.2±0.8 | 24.8±1.9 | 16.7±1.2 | 27.43±0.95 |
D-SR | 175.2±11.6 | 121.7±7.1* | 55.7±1.9** | 26.1±1.3 | 22.5±1.4* | 15.62±1.23** |
注:D-Veh组和D-SR组相比,*P<0.05,**P<0.01;下同 Notes:Comparison between D-Veh and D-SR,*P<0.05,**P<0.01;the same below |
qPCR结果表明(图 2:a),与D-Veh组相比,在D-SR组小鼠的皮下脂肪、内脏脂肪、骨骼肌和肝脏组织中,SR141716分别抑制了CB1基因mRNA表达水平的85.1%、87.8%、72.6%和91.3%(P<0.01)。同时,CB1基因mRNA表达水平在S-Veh组和D-Veh组小鼠各组织间的差异有统计学意义(P<0.05)。Western Blot结果表明(图 2:b),CB1蛋白质表达量在D-SR组小鼠的皮下脂肪、内脏脂肪、骨骼肌、肝脏、心脏等组织中明显降低(P<0.05)。
2.3 CB1显著上调CPT1A、CPT1B基因的mRNA表达水平与D-Veh组相比,CPT1A的表达量在D-SR组小鼠的肝脏中显著上调(P<0.05),CPT1B的表达量在D-SR组小鼠的皮下脂肪、内脏脂肪、骨骼肌组织中显著上调(P<0.05)(图 3)。
3 讨论CB1是脂质类EC信号系统的主要受体,在脂肪代谢平衡、脑发育、炎症反应、神经系统功能障碍及食欲控制等机制中发挥着重要作用(Matias et al., 2006;Katona & Freund,2012;Lutz et al., 2015;Lu & Mackie,2016)。SR141716作为CB1受体抑制剂已被商品化为食欲抑制剂、减肥药物(Rinaldi-Carmona et al., 1994)。Leite等(2009)研究证实SR141716能够促进脂类分解,降低体质量,也可以通过降低TG、游离脂肪酸和TC,增高HDL/LDL比值改善血脂异常状况。
本研究旨在观察CB1对脂质代谢、体质量、肝脏质量、血清中TG、TC、HDL、LDL、脂联素和瘦素含量的影响。结果表明,SR141716灌胃组小鼠的体质量、肝脏质量、血清中TC和瘦素含量显著降低,血清中HDL和脂联素含量增加,然而,血清中TG和LDL含量没有明显改变。本实验研究结果与CB1可以降低体质量、减小腹围、改善肝脂肪变性及血脂异常状况的结论(Tang et al., 2012)基本一致。
大量研究数据证实,外周组织中CB1有望成为治疗肥胖和代谢综合征的新靶点(Crespillo et al., 2010;Silvestri et al., 2011)。前期体外实验证明,SR141716降低了CB1 mRNA水平的表达,但是增加了CPT1A和CPT1B的表达,从而减少了脂肪沉积(Zhang et al., 2014)。研究结果显示,肥胖模型小鼠皮下脂肪、内脏脂肪、骨骼肌和肝脏组织中CB1在mRNA和蛋白质水平均呈现高表达。SR141716灌胃处理后,CB1的表达显著下降,而CPT1A、CPT1B的表达随之升高。CPT1A的高表达主要在肝脏,而在骨骼肌、皮下脂肪、内脏脂肪组织中低表达。与CPT1A相反,CPT1B高表达在骨骼肌、皮下脂肪、内脏脂肪组织,低表达在肝脏。Nogueiras等(2008)的结果也证实,CB1受抑制后上调CPT1,从而促进脂肪分解、抑制脂肪生成。值得一提的是,低水平的CB1可在心脏中检测到,然而本实验中CPT1A和CPT1B在心脏的表达水平非常低,与前期在猪和心肌细胞上的研究结果相反(Zhang et al., 2014)。因此,关于CPT1A和CPT1B在心脏中的作用机制,尚需进一步研究证实。
本研究结论证实CB1通过作用于CPT1A、CPT1B发挥对脂质代谢的调节作用,提高血清中TC、HDL、脂联素和瘦素含量,为靶向调控脂质代谢提供了可靠的依据。
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