G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptor，GPCR)在真核生物中是最大、种类最多的细胞表面受体家族。人类基因组中参与编码GPCR的基因超过1 000个，广泛参与机体稳态、胚胎发育以及学习、记忆、视觉、嗅觉和味觉调控等过程，其胞外配体包括离子和小分子等，如脂肪酸、氨基酸、多肽和类固醇等(Takeda et al., 2002；Perez，2003；Vassilatis et al., 2003；Fredriksson & Schiöth，2005)。鉴于GPCRs在机体内介导的广泛生理效应，在制药工业中，50%的药物靶标设计针对GPCRs研发(Klabunde & Hessler，2002；Civelli，2005；Winzell & Ahrén，2007)。

G蛋白偶联受体119(GPR119)是一类A型视紫红质G蛋白偶联受体(rhodopsin-like GPCR)，具典型7次跨膜结构，与胞内G蛋白偶联，介导下游效应(Hansen et al., 2012)。目前，在大鼠Rattus norvegicus、小鼠Mus musculus、仓鼠Mesocricetus auratus、黑猩猩Pan troglodytes、恒河猴Macaca mulatta、牛Bos taurus和狗Canis lupus familiaris等哺乳动物中，GPR119基因已获得鉴定(Overton et al., 2008)。在人Homo sapiens、小鼠中，GPR119基因cDNA全长1 008 bp，编码335个氨基酸的前体蛋白，具典型7次跨膜结构，并由单一外显子编码(Bonini et al., 2001；Ohishi et al., 2001)。GPR119一直以来被视为孤儿受体，但有文献报道其可以被内源性配体溶血卵磷脂和油酰乙醇胺激活(Soga et al., 2005；Overton et al., 2006)。GPR119可与G_αs蛋白偶联，结合配体后，可刺激下游cAMP水平上升(Holst et al., 2011)，进而刺激β细胞胰岛素以及肠道K细胞的葡萄糖依赖性，促胰岛素肽(GIP)和L细胞的胰高血糖素样肽1(GLP-1)的释放(Chu et al., 2008)。GIP与GLP-1是最重要的促胰岛素释放因子，由此，GPR119激动剂成为治疗糖尿病药物研发的重要候选对象，解析GPR119基因序列及其编码蛋白结构备受关注(Kang，2013)。

尽管在哺乳动物中，GPR119的功能已逐步明确，但在包括鸟类在内的低等脊椎动物类群中，关于GPR119的研究几属空白。本研究以家鸡Gallus gallus为研究对象，从其小肠组织中克隆得到1个似GPR119(GPR119-like)新基因，并确定其氨基酸序列。因该基因与鸡和人的GPR119基因具较高序列同源性，因此将其命为cGPR119b。在此基础上，本研究采用实时荧光定量PCR技术首次探究了cGPR119b在家鸡组织中的表达情况。这些结果为探究家鸡GPR119b的内源性配体、胞内信号通路，以及其在家鸡组织中的生理效应奠定基础。

本实验中成体家鸡全部购自成都活禽市场。家鸡各组织放入液氮速冻后保存于-80 ℃备用。

本实验中用于序列克隆的高保真DNA聚合酶(KOD-FX)体系、各种限制性内切酶、T4 DNA连接酶、Easy-Taq DNA聚合酶、dNTP、反转录酶购自TaKaRa；引物合成及测序由北京华大六和股份有限公司完成；RACE试剂盒购自Clontech；RNAzol购自Molecular Research Center；大肠杆菌Eschericha coli DH5α由本实验室制备保存；DNA纯化胶回收试剂盒购自上海生工生物有限公司。

取家鸡心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、肌肉、胰腺、精巢、卵巢、垂体，以及脑部各区域(大脑、下丘脑)和肠道分区(十二指肠、空肠、回肠、盲肠、直肠)，放入液氮中速冻，并于液氮中充分研磨，将组织粉末与RNAzol混合均匀，加入240 μL DEPC-H₂O混匀，4 ℃、12 000 r·min^-1离心15 min；取上清，加入3 μL阿司咪唑，漩涡后于4 ℃、12 000 r·min^-1离心10 min；取上清，加入等体积异丙醇，4 ℃、12 000 r·min^-1离心15 min；弃上清，加入70%的乙醇漂洗2次，4 ℃、12 000 r·min^-1离心3 min；弃上清，用DEPC-H₂O溶解沉淀，-80 ℃保存。

以各组织RNA为模板，反转录获得cDNA。反转录反应体系为：RNA 2 μg，Oligo-dT 1 μL，加DEPC-H₂O补足至5 μL，70 ℃加热10 min，取出后冰浴2 min；再加入2 μL 5×Buffer，dNTPs 0.5 μL(终浓度2 mmol·L^-1)，MMLV逆转录酶0.5 μL，2 μL DEPC-H₂O，42 ℃孵育1.5 h，70 ℃加热10 min。反应产物用DEPC-H₂O稀释至50 μL，MiliQ-H₂O作cDNA模板，-20 ℃贮存。

根据NCBI数据库中的预测序列(LOC101750121)设计引物(表 1)，扩增cDNA获得GPR119b基因全长，根据测序序列，设计检测cGPR119b组织表达的特异性引物。

以小肠cDNA为模板，采用PCR对cGPR119b基因进行扩增。PCR反应体系：5 μL 2×KOD Buffer，2 μL cDNA模板，2 μL 2 mmol·L^-1 dNTPs，0.1 μL rU1引物，0.1 μL rL1引物，0.2 μL KOD-Fx，加水补足至10 μL。反应条件为：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性10 s，62 ℃退火30 s，68 ℃延伸60 s，34个循环；最后72 ℃延伸20 min。取3 μL产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

根据SMART RACE cDNA Amplification Kit试剂盒制备cDNA模板。在此基础上，利用基因特异性引物PCR扩增cGPR119b基因的5'-UTR。PCR反应体系为：5 μL 2×KOD Buffer，2 μL cDNA模板，2 μL 2 mmol·L^-1 dNTPs，0.1 μL UPM引物，0.1 μL GSP引物，0.2 μL KOD-Fx，加水补足至10 μL。反应条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性10 s，72 ℃退火3 min，共5个循环；94 ℃变性10 s，70 ℃退火3 min，共5个循环；94 ℃变性10 s，68 ℃延伸3 min，25个循环；最后68 ℃延伸10 min。反应结束后，取3 μL产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。取上述产物稀释1 000倍作为模板，进行第二轮巢氏PCR反应。PCR反应体系及条件同上。

对获得的PCR产物进行加A反应。反应体系为：PCR产物4.5 μL，10×A-attachment Mix 0.5 μL，反应条件为60 ℃加热1 h。将加A后的PCR产物进行TA连接，反应体系为：加A后反应液1.5 μL，2×Ligation Buffer 2.5 μL，pTA2载体0.5 μL，T4 DNA连接酶0.5 μL，总体积5 μL。将TA连接产物转化DH5α进行菌落PCR筛选，将筛选到的阳性克隆进行质粒提取、双向序列测定。

采用实时荧光定量PCR检测cGPR119b基因在成体家鸡各组织中的表达情况。PCR反应体系为：2 μL组织cDNA模板，1 μL 10×Easy-Taq Buffer，0.2 μL EvaGreen，0.2 μL dNTPs，0.15 μL qU1，0.15 μL qL1，0.15 μL Easy-Taq。PCR反应条件为：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性20 s，62 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，34个循环；最后72 ℃延伸5 min。实时荧光定量PCR的结果按照2^-ΔΔCT法进行数据分析(Schmittgen & Livak，2008)，步骤如下：首先将各组织样品cGPR119b基因的CT值减去对应组织内参基因β-actin的CT值，得到各组织的ΔCT值；然后将cGPR119b基因在回肠中的表达量选作参考，并将上一步分别所得的各组织的ΔCT值减去回肠组织的平均ΔCT值，得到ΔΔCT值；最后计算2^-ΔΔCT值，得到各组织相对回肠中cGPR119b基因的表达量倍数，即cGPR119b基因在各组织间的相对表达量。

以小肠cDNA为模板，根据表 1引物rU1+rL1，进行PCR扩增，得到cGPR119b基因编码区的全长cDNA序列。扩增片段约为1 kb，与预测基因片段大小一致(图 1)。将该片段进行胶回收，并克隆到pTA2载体上，经阳性克隆筛选与酶切验证后，选3个克隆进行测序分析。序列比对显示，成功克隆到cGPR119b基因的编码区序列。

图 1 cGPR119b基因开放阅读框区域扩增 Fig. 1 Amplification of the open reading frame of chicken GPR119b-like gene

图选项

cGPR119b基因开放阅读框长954 bp，由单一外显子编码，编码317个氨基酸的前体蛋白。与其他GPCRs一致，cGPR119b同样含典型7次跨膜结构域，在第二胞内区前端有1个D-R-Y基序(图 2)。通过与家鸡基因组序列进行比对分析，发现cGPR119b基因位于家鸡9号染色体上。cGPR119b的氨基酸序列与家鸡及人GPR119序列相似度相对较低(35%~36%)，但与绿头鸭Anas platyrhynchos(XM_013100626)、绿海龟Chelonia mydas(XM_007072744)、西部锦龟Chrysemys picta bellii(XM_005310936)和火鸡Meleagris gallopavo(XM_010715066)的GPR119b具有很高的一致性，分别为79.9%、61.0%、62.3%和95.5%(图 2)。

图 2 家鸡(Gg)GPR119b的氨基酸序列与绿头鸭(Ap)、绿海龟(Cm)、西部锦龟(Cb)、火鸡(Mg)的比对分析 Fig. 2 Amino acid sequence alignment of chicken (Gg) GPR119b with that of Anas platyrhynchos (Ap), Chelonia mydas (Cm), Chrysemys picta bellii (Cb), Meleagris gallopavo (Mg) 阴影部分显示7次跨膜区，方框显示视紫红质亚家族的典型“D-R-Y”基序，圆点表示与家鸡GPR119b相同的氨基酸残基，破折号表示氨基酸残基的缺失 The putative seventransmembrane domains (TM1-7) were shaded, the"D-R-Y"motif was boxed, dots indicate the amino acids identical to chicken GPR119b and dashes indicate the gaps in the sequence

图选项

为探究cGPR119b基因的结构，以小肠cDNA为模板，采用5'-RACE方法扩增cGPR119b基因的5'-UTR区域，成功获得5'-UTR序列。结果显示，cGPR119b基因的5'-UTR大小为678 bp。通过与家鸡基因组序列比对，发现该区域不含新的外显子。由此可知，与GPR119基因一致，cGPR119b基因也由单一外显子组成(图 3)。

图 3 cGPR119b的基因组成(5'-UTR+编码区)(A)及其5'-UTR区域核苷酸序列(B) Fig. 3 Composition of chicken GPR119-like gene (cGPR119b) (A) and its 5'-UTR region nucleotide sequence (B)

图选项

实时荧光定量PCR结果显示，cGPR119b基因在大脑、肝脏、肾脏、卵巢、精巢、垂体、胰腺、皮肤、脂肪、肺、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、直肠等组织有表达。其中，cGPR119b基因在肝脏、肾脏、盲肠和精巢的表达量较高；在胰腺、皮肤、脂肪和肺等组织中仅有微量表达，而在下丘脑和脾脏不表达(图 4)。

图 4 cGPR119b基因在家鸡组织中的表达 Fig. 4 Chicken GPR119b-like gene expression in chicken tissues IL.回肠，Br.大脑，Sp.脾脏，Ki.肾脏，Ov.卵巢，Te.精巢，Pi.垂体，Pa.胰腺，Fat.脂肪，Du.十二指肠，Je.空肠，Lu.肺，Ce.盲肠，Li.肝脏，Re.直肠，Hy.下丘脑，Sk.皮肤 IL. ileum, Br. brain, Sp. spleen, Ki. kidney, Ov. ovary, Te. testis, Pi. pituitary, Pa. pancreas, Fat. fat, Du. duodenum, Je. jejunum, Lu. lung, Ce. cecum, Li. liver, Re. rectum, Hy. hypothalamus, Sk. skin

图选项

GPR119是A型视紫红质G蛋白偶联受体家族成员。在哺乳类动物中，该基因高表达于胰腺β细胞和PP细胞以及小肠组织的内分泌L细胞，参与胰岛素的释放调节，成为制药公司研发糖尿病治疗用药的靶标，备受关注(Moran et al., 2016)。本文首次报道了cGPR119b基因序列及其组织表达图谱，研究结果为探究cGPR119b基因在家鸡中的生理效应奠定基础。

利用RT-PCR技术成功从家鸡小肠中克隆得到cGPR119b基因的完整编码区序列。序列分析显示，cGPR119b基因的cDNA全长954 bp，编码具317个氨基酸的前体蛋白，该蛋白由单一外显子编码，具典型7次跨膜结构域，第二胞内区域前端含D-R-Y基序。氨基酸序列对比发现，家鸡GPR119b分别与绿头鸭、绿海龟、西部锦龟和火鸡中预测的GPR119b有79.9%、61.0%、62.3%、95.5%的序列相似度，但与人、小鼠和家鸡GPR119(JQ768805，本实验室已克隆)的序列相似度则较低，因此，本研究将该似GPR119基因命名为cGPR119b。有趣的是，GPR119b基因在哺乳动物中已消失。

采用5'-RACE技术成功获得cGPR119b基因的5'-UTR。测序结果显示，该5'-UTR长度为678 bp，暗示该5'-UTR区或含未知调控序列，或参与控制cGPR119b基因翻译效率。利用实时荧光定量PCR方法解析cGPR119b基因在家鸡组织中的表达图谱，发现cGPR119b基因在肝脏、精巢、肾脏和盲肠等组织表达量较高，而在胰腺和肠分区组织中的表达量较低。该结果与哺乳动物GPR119基因的组织表达存在较大差异(Chu et al., 2007；Odori et al., 2013)。在大鼠中，GPR119基因主要在胰腺组织表达(Sakamoto et al., 2006)；在人中，GPR119基因在胰腺和肠内分泌细胞高表达(Chu et al., 2008)。GPR119基因在家鸡中存在2个拷贝(cGPR119与cGPR119b)。家鸡GPR119b基因组织表达图谱区别于其在人、大鼠中的表达图谱，这一结果暗示：cGPR119b基因或与哺乳动物及家鸡GPR119基因的功能显著不同，值得深入探究。