硬骨鱼种类繁多，有21 000多种(杨万喜等，2000)，其生殖特点不尽相同，已有研究显示，硬骨鱼类精子结构在系统发生和生物进化过程中有很高的多样性和随机性(Guo et al., 2016)。硬骨鱼类精子结构由物种的分类地位和生殖方式共同决定。多种鱼类精子的超微结构研究表明，同一科或亚科的鱼类精子结构有很高的相似性，精子结构特征对于区分种间关系模式十分重要(Gusmão-Pompiani et al., 2005；Guo et al., 2016)。此外，精子结构能与一些普通形态学特征结合在一起，更好地运用在鱼类系统发育分析中(Gusmão-Pompiani et al., 2005)。

大口黑鲈Micropterus salmoides俗称加州鲈鱼、黑鲈，隶属硬骨鱼纲Osteichthyes鲈形目Perciformes鲈亚目Porcoide太阳鱼科Centrarchidae黑鲈属Micropterus，肉质鲜美、生长快、易起捕，是一种纯淡水、广温、肉食性的经济鱼类。大口黑鲈原产于美国加利福尼亚州，1983年初引入我国，经过试养与人工繁殖获得成功，已成为我国重要的淡水养殖鱼类之一(王利娟，2015)。目前，有关太阳鱼科鱼类精子结构的研究相对较少，对大口黑鲈的研究大多集中在与其生长性状相关的方面(樊佳佳等，2009；陈乃松等，2010；李镕等，2011)。本研究旨在通过对大口黑鲈精子超微结构的观察，探讨大口黑鲈精子的结构特征，丰富太阳鱼科鱼类的生殖生物学资料，为该科鱼类的繁育推广提供科学参考。

实验材料由河南省鹤壁市淇县淇河鲫良种场提供。在大口黑鲈性成熟季节，挑选2龄、体质量0.8 kg左右、体型健壮、健康良好的雄鱼10尾备用。

采用绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，HCG)与促黄体素释放激素类似物(luteinizing hormone releasing hormone-analog，LRH-A)的混合溶液进行人工催产，催产剂量为：每千克体质量的雄鱼注射HCG 1 000 IU+LRH-A10 μg。注射后放入提前准备好的孵化池中，等待其精子成熟。水温25 ℃，30 h(效应时间)后检查精子成熟情况并采集。采精时腹部朝上，轻压腹部，挤出膀胱中的尿液，医用棉纱擦干鱼体后采集精子(要求无粪便、无血液等污染)。放入盛有2.5%戊二醛溶液的玻璃瓶中，密封，标记，4 ℃冰箱保存，用于电镜制样和实验观察。

将上述精子样品用磷酸缓冲液(PBS，0.1 M，pH7.2~7.4)漂洗，滴加1%锇酸进行再固定；依次用梯度乙醇(30%、50%、70%、80%、90%、100%、100%)、乙醇：丙酮(3：1、1：1、1：3)、丙酮(2次)脱水，每次10 min；二氧化碳临界点干燥，干燥后的样品放入离子镀膜仪中喷金镀膜。置扫描电镜(日立-4800)下观察并拍照。

将上述精子样品用PBS(0.1 M，pH7.2~7.4)漂洗，滴加1%锇酸进行再固定；依次用梯度乙醇(30%、50%、70%、80%、90%、100%、100%)、乙醇：丙酮(3：1、1：1、1：3)、丙酮(2次)脱水，每次10 min；环氧树脂(Epon812)包埋，莱卡(Leica U7)超薄切片机切片，5%醋酸铀-柠檬酸铅双染法染色，日立HT-7700透射电镜观察、拍照。

采用Photoshop CS5、SPSS 20.0对图片和数据分别进行处理、分析，所有数据以平均数±标准差表示。

扫描电镜结果显示，大口黑鲈精子由头部和鞭毛组成，中段不明显，无顶体(图版Ⅰ：1)。精子全长25.07 μm±4.93 μm(n=30)，头部近球形，直径1.73 μm±0.29 μm(n=30)，鞭毛长23.00 μm±4.86 μm(n=30)。

透射电镜结果显示，精子由头部、中段和鞭毛组成，无顶体(图版Ⅰ：4，8)。

精子头部主要由细胞核构成，细胞核由双层核膜包裹，除核底端外，周围核膜与质膜紧密相连；细胞核呈蘑菇形，染色质电子致密且高度浓缩成簇，被一些电子透明区分散开(图版Ⅰ：2)，细胞核近鞭毛端向内凹陷成较浅的核窝(图版Ⅰ：4)。成熟的精子细胞核横轴与鞭毛垂直(图版Ⅰ：4)；未成熟的精子细胞核横轴与鞭毛平行，尚未形成核窝，或细胞核发生旋转但还未旋转完全，细胞核横轴与鞭毛处于既不平行，也不垂直的状态(图版Ⅰ：3)。

精子中段由袖套和中心粒复合体组成(图版Ⅰ：4)。袖套呈筒状，连于细胞核的后端。中央的空腔称为袖套腔，袖套腔两侧袖套大小相似，内含少量细胞质、线粒体和囊泡。线粒体在两侧随机分布，总数(17±4)个(n=30)，多种形态同时存在(图版Ⅰ：4~7)。囊泡有2种类型：一种囊泡内充满电子致密物质，一种无电子致密物质。位于袖套的细胞质膜因其所处的位置不同分为袖套内膜和袖套外膜，袖套内膜位于袖套的内侧，包围袖套腔，袖套外膜位于袖套的外侧。中心粒复合体由近、远端中心粒构成。成熟的大口黑鲈精子近端中心粒位于核窝内，与细胞核纵轴垂直，远端中心粒与近端中心粒垂直，始于核窝末端，位于核窝外，并与鞭毛相连，形成鞭毛基部，近、远端中心粒均具有“9+2”二联微管结构(图版Ⅰ：4，5)。

精子鞭毛细长(图版Ⅰ：8)，起始部分位于袖套腔中，绝大部分伸出袖套之外。鞭毛的中心部分是轴丝。轴丝接于基体之后，具有典型的“9+2”二联微管结构(图版Ⅰ：4~7)。轴丝的外方存在由细胞质膜向两侧扩展而成的侧鳍(图版Ⅰ：9)。没有囊泡和线粒体等结构(图版Ⅰ：8)。

图版Ⅰ 大口黑鲈精子超微结构 PlateⅠ The ultrastructure of sperm of Micropterus salmoides 1.扫描电镜下大口黑鲈精子结构，比例尺=5 μm；2.精子头部横切，比例尺=1 μm；3.未成熟精子纵切，比例尺=1 μm；4.成熟精子纵切，比例尺=1 μm；5.精子中段横切，比例尺=500 nm；6.精子中段纵切，比例尺=1 μm；7.精子中段纵切，比例尺=500 nm；8.精子鞭毛纵切，比例尺=1 μm；9.精子鞭毛横切，比例尺=500 nm；AX.轴丝，CS.袖套腔，DC.远端中心粒，E.电子透明区，F.鞭毛，H.头部，La.侧鳍，M.线粒体，MP.中段，MT.微管，N.细胞核，PC.近端中心粒，V.囊泡。 1. sperm under SEM, scale bar=5 μm; 2. cross section of the head, scale bar=1 μm; 3. longitudinal section of the immature sperm, scale bar=1 μm; 4. longitudinal section of the mature sperm, scale bar=1 μm; 5. cross section of the midpiece of the sperm, scale bar=500 nm; 6. longitudinal section of the midpiece, scale bar=1 μm; 7. longitudinal section of the midpiece, scale bar=500 nm; 8. longitudinal section of the sperm flagellum, scale bar= 1 μm; 9. cross section of the sperm flagellum, scale bar=500 nm; AX. axoneme, CS. central space of the sleeve, DC. distal centriole, E. electron lucent area, F. flagellum, H. head, La. lateral fin, M. mitochondrion, MP. midpiece, MT. microtubule, N. nucleus, PC. proximal centriole, V. vesicle.

图选项

硬骨鱼类精子的结构特征差异很大，很难有统一的标准来定义精子类型(Mattei，1991)。Mattei(1991)最早对硬骨鱼类精子结构的多样性进行了系统的描述，后来Lahnsteiner和Patzner(2008)又对其进行了补充和完善。硬骨鱼类精子分为头部、中段和尾部，总长20~100 μm，头部无顶体。Mattei在早期研究中依据硬骨鱼类精子在形成过程中细胞核是否移动将精子分成2种基本类型：Ⅰ型和Ⅱ型，此外还有一种介于两者之间的中间类型。当细胞核发生旋转时，鞭毛与细胞核垂直并延伸到细胞核，为Ⅰ型精子；当细胞核不发生旋转时，细胞核与鞭毛平行，为Ⅱ型精子；当细胞核发生旋转而旋转未完全时，鞭毛与细胞核既不平行也不垂直，为介于Ⅰ型和Ⅱ型之间的中间类型(Mattei，1970)。之后又发现了新的精子类型，新类型精子的形成与其他所有的硬骨鱼类精子相反，即在精子形成的过程中，细胞核不发生旋转，鞭毛轴丝从细胞核的中心形成，此种类型为长须鲶科Pimelodidae鱼类的精子所特有，称为Ⅲ型(Maricchiolo et al., 2010)。Ⅱ型精子因在鲈形目中最为常见而被称为“鲈形目精子”(胡谋等，2014)。已有研究的鲈形目各科鱼类精子中，石首鱼科Sciaenidae、科Serranidae、真鲈科Percichthyidae、梦鲈科Moronidae和鲹科Carangidae均为Ⅱ型精子，马鲅科Polynemidae为中间型精子，须鲷科Mullidae、中棘鱼科Centracanthidae、鲷科Sparidae和太阳鱼科为Ⅰ型精子(Mattei，1970；Gusmão-Pompiani et al., 2005)。

大口黑鲈精子分为头部、中段和鞭毛三部分，总长约25.07 μm，头部无顶体，符合硬骨鱼类精子结构的一般特征。精子细胞核发生转动，细胞核横轴与鞭毛垂直，属于Ⅰ型精子，与Baccetti等(1987)、Sprando和Russel(1988)描述的太阳鱼科精子类型一致。

大口黑鲈精子头部近球形，直径约1.73 μm，与鲷科的平鲷Rhabdosargus sarba和真赤鲷Pagrus major相似(Gwo et al., 2004)。头部主要由细胞核构成，细胞核呈蘑菇形，染色质高度浓缩成簇，均匀分布，被一些电子透明区分散开，近鞭毛端向内凹陷形成较浅的核窝。鲈形目精子结构研究中发现，多数精子细胞核内染色质高度浓缩成团并无分散的电子透明区(Gwo et al., 2004；Maricchiolo et al., 2010)，仅有少数物种精子细胞核与大口黑鲈相似(胡谋等，2014)；核窝深浅不一，须鲷科、鲷科、中棘鱼科鱼类的精子核窝较深(超过细胞核直径的一半)(Mattei，1991)，科精子核窝属中间类型(约细胞核一半)(García-Díaz et al., 1999)。

大口黑鲈精子中段的袖套结构、线粒体数目和形态与其他鲈形目鱼类精子有明显区别。研究表明，大口黑鲈精子中段由袖套和中心粒复合体组成。袖套呈筒状，连于细胞核的后端。中央的空腔称为袖套腔，袖套腔两侧袖套大小相似，内含少量细胞质、线粒体和囊泡，符合一般硬骨鱼类精子的结构特征。线粒体在两侧随机分布，总数(17±4)个，多种形态同时存在；囊泡存在2种类型，一种囊泡内充满电子致密物质，一种无电子致密物质。研究表明，大口黑鲈精子的袖套结构十分明显，但在其他学者对诸多鲈形目鱼类精子结构的研究中，则鲜有精子中段袖套结构的报道(Lahnsteiner & Patzner，1995；García-Díaz et al., 1999；Gwo et al., 2004；胡谋等，2014)，报道中所提及的中心粒复合体和线粒体被细胞质包围形成的通道与袖套的结构功能类似，但其形态差别较大；且其中的线粒体数目极少，如鲷科有1~2个线粒体(Lahnsteiner & Patzner，1995；Gwo et al., 2004)，中棘鱼科仅有1个线粒体(Jamieson，1991)，数量较多的须鲷科也仅含有5个线粒体(Mattei, 1970, 1991)，这些物种中线粒体的形状和结构基本相同，多为球形，个体较大，直径约1 μm，切面显示内部有线粒体，相反，大口黑鲈精子中的线粒体数目多，而体积小。分析比较其他已有的研究，大口黑鲈精子结构中的袖套结构和线粒体数目与鲤科鱼类更为相似(尤永隆，林丹军，1996)，而线粒体的形态结构却和部分两栖类动物精子的线粒体结构相似(Selmi et al., 1997)。

中心粒复合体由近、远端中心粒构成。大口黑鲈成熟精子的核窝较浅，仅近端中心粒位于核窝内，与细胞核纵轴垂直，远端中心粒与近端中心粒垂直，始于核窝末端并与鞭毛相连，形成鞭毛基部，近、远端中心粒均具有“9+2”二联微管结构。一些鲈形目鱼类精子结构中核窝较深(Lahnsteiner & Patzner，1995)，其中心粒复合体多在核窝内。

硬骨鱼类精子的鞭毛结构有多种类型。同大多数硬骨鱼类的精子结构一样，大口黑鲈的精子为单鞭毛型，鞭毛的主要结构为轴丝，有典型的“9+2”二联微管结构，鞭毛轴丝外侧有细胞质膜向两侧扩张形成的侧鳍。某些鲇形目Siluriformes鱼类精子具有双鞭毛，如棘甲鲶科Doradidae的韦氏上棘Anadoras weddellii和钝囊鲶属Amblydoras的鱼类(Quagio-Grassiotto et al., 2003)，鲈形目慈鲷科Cichlidae鱼类的精子也具有双鞭毛(Matos et al., 1995)；而鲈形目天竺鲷科Apogonidae鱼类的精子则包含单鞭毛和双鞭毛2种类型(Lahnsteiner，2003)。

不同鱼类的精子鞭毛侧鳍形态不同，如须鲷科羊鱼属Mullus的红鲻鱼Mullus barbatus精子鞭毛两侧均有侧鳍；鲷科的重牙鲷Diplodus sargus和牛眼鲷Boop boops精子鞭毛仅一侧有侧鳍(García-Díaz et al., 1999)；而鲷科的真鲷和平鲷以及中棘鱼科鱼类精子鞭毛两侧均无侧鳍(Jamieson，1991；Lahnsteiner & Patzner，1995)。目前，关于侧鳍的作用缺乏统一解释，其生物学意义仍有待进一步验证。