洲大蠊Periplaneta americana隶属于蜚蠊目Blattodea蜚蠊科Blattidae大蠊属Periplaneta，俗称蟑螂，是世界性卫生害虫，广泛分布于热带、亚热带地区。蜚蠊入药早有历史记载(孙星衍，孙冯翼，1955)，近年来，美洲大蠊提取物被发现具有很高的药用价值，目前已有多个产品相继研发成功，如康复新、心脉隆注射液、肝龙胶囊等(史未名，2012)。康复新是美洲大蠊干燥虫体的乙醇提取物研制产品，已经广泛应用于临床创伤治疗。舒崇湘等(2001)使用美洲大蠊多元醇提取物W₁₁-a₁₂作为全身放射损伤的治疗药物，研究表明，美洲大蠊提取物通过增加细胞外基质表达量来刺激创伤细胞增殖、加速伤口愈合速度和质量。临床研究表明，康复新液对手足口病、胃肠溃疡、痔疮、肛瘘和肛裂等疾病都有很好的治疗效果(刘玉媛，2006)。胡艳芬等(2009)发现美洲大蠊提取物对3株人肺癌细胞具有体外抑制作用；何正春等(2009)发现美洲大蠊提取物对3株人体消化系统肿瘤细胞具有体外抑制作用；蒋永新等(2006)发现美洲大蠊提取物能在体外诱导胃腺癌细胞BGC-823、肺腺癌细胞GLC、卵巢癌细胞等发生凋亡。

结直肠癌是胃肠道癌症中最常见的恶性肿瘤之一，也是全球第三大最常见的癌症疾病(汪建平等，2009)。顺铂(cisplatin)是一种重要的抗肿瘤药物，用于治疗多种类型的癌症(Rosenberg，1999)，主要作用靶点为DNA，可以促进DNA链内及链间交联(主要为链内交联)，导致DNA损伤，当DNA不能被修复时导致细胞凋亡(Siddik，2003)。尽管顺铂在临床治疗肿瘤上具有较好的效果，但是其副作用以及肿瘤耐药性问题，严重影响了它在临床治疗中的应用潜力(Kelland，1993；Ferlay et al., 2015)。

转录组是某个物种或者特定细胞类型产生的所有转录本的集合，能够反映基因组在特定条件下的表达情况，从整体水平了解基因的功能和结构，是研究细胞表型和功能的一个重要手段。转录组已经广泛应用于基础研究、临床诊断和药物研发等领域(祁云霞等，2011)。虽然有很多文献报道了美洲大蠊提取物能够抑制多种肿瘤细胞生长，甚至使肿瘤细胞凋亡，但是分析美洲大蠊提取物与顺铂联合处理结直肠癌细胞，对其信号通路影响的研究还未见报道。因此，本文基于RNA-seq技术分析美洲大蠊提取物联合顺铂处理的结直肠癌细胞内信号通路的变化，为美洲大蠊提取物的应用及开发提供数据。

1 材料和方法 1.1 材料

人结直肠癌细胞低转移性细胞株(RKO细胞)为美国匹兹堡大学Lin Zhang教授实验室赠送；顺铂从中国上海蓝木化工公司购买；美洲大蠊提取物为康复新液(KFXY)、精粉(JF)、精粉酵解液(JFJJ)，由四川好医生药业集团提供。

1.2 方法 1.2.1 细胞培养以及加药处理

RKO细胞用含有10%胎牛血清、青霉素100 U·mL^-1和链霉素100 μg·mL^-1的DMEM完全培养基(美国Hyclone公司)，在5%CO₂、37 ℃恒温培养箱中培养。待细胞汇合度为90%~95%时，进行细胞传代培养并铺板。细胞以1×10⁵/mL的密度接种于12孔板中，24 h后同时加入30 μM cisplatin和一定浓度的美洲大蠊提取物(0.6% KFXY、0.8% JFJJ、100 μg·mL^-1 JF)处理48 h，然后用RNA抽提试剂TRIzol(中国大连TaKaRa)收集细胞，并冻存在-80 ℃超低温冰箱。

1.2.2 RNA提取以及检测

按照RNA提取试剂盒(TaKaRa)操作方法提取样品RNA，利用琼脂糖凝胶电泳检测RNA降解程度以及是否有污染，Nanodrop检测RNA的纯度和浓度。

1.2.3 文库构建以及测序分析

RNA样品检测合格后，用带有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物mRNA。随后加入fragmentation buffer将mRNA打断成短片段，以mRNA为模板，用六碱基随机引物合成一链cDNA，然后加入缓冲液、dNTP和DNA polymerase Ⅰ和RNase H合成二链cDNA，再用AMPure XP beads纯化双链cDNA。纯化的双链cDNA先进行末端修复、加A尾并连接测序接头，再用AMPure XP beads进行片段大小选择。最后进行PCR扩增，并用AMPure XP beads纯化PCR产物，得到最终的文库。文库构建完成后，先使用Qubit 2.0进行初步定量，稀释文库至1.5 ng·μL^-1，随后使用Agilent 2100对文库的insert size进行检测，符合预期后，使用Q-PCR方法对文库的有效浓度(＞2 nM)进行准确定量，以保证文库质量。构建好的文库用Illumina HiSeq^TM2500进行测序。

1.2.4 基因表达量统计和样品间差异表达分析

基因表达量的计算使用Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped reads(FPKM)法。FPKM法能消除基因长度和测序量差异对计算基因表达的影响，计算得到的基因表达量可直接用于比较不同样品的基因表达差异。然后采用EdgeR进行差异表达转录本的鉴定，利用FDR与log₂FC筛选差异基因，筛选条件为FDR＜0.05且|log₂FC|＞1。

1.2.5 差异基因GO注释和KEGG Pathway分析

Gene Ontology(GO)是一个国际标准化的基因功能分类体系，提供了一套动态更新的标准词汇表来全面描述生物体中基因和基因产物的属性。GO总共有3个本体，分别描述基因的分子功能(molecular function)、细胞组分(cellular component)、参与的生物过程(biological process)(Botstein et al., 2000)。东京基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes Pathway，KEGG)是一个整合了基因组、化学和系统功能信息的生物系统数据库，它提供了一个参考的数据库，将基因对比到生物活动的每个信号通路中(Kanehisa et al., 2008)。每一组的差异基因用WEGO进行样品间差异基因GO的分类，用DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)进行KEGG通路富集分析。

2 结果与分析 2.1 测序结果分析

采用Illumina HiSeq^TM2500对结直肠癌细胞对照组、30 μM cisplatin和0.6% KFXY联合处理组、30 μM cisplatin和0.8% JFJJ联合处理组、30 μM cisplatin和100 μg·mL^-1JF联合处理组进行测序。各组经过数据过滤后得到的reads数量分别为22 770 909、24 048 295、26 977 761、32 367 493，碱基错误率分别为0.04%、0.03%、0.03%、0.03%，Q20的值分别为94.42%、95.84%、95.78%、95.72%，Q30的值分别为87.35%、90.08%、89.87%、89.87%，每个样品的GC含量分别为50.88%、50.83%、50.75%、51.7%(表 1)。以上数据表明测序得到的数据量和质量都很高。

2.2 样品间差异基因统计

采用EdgeR进行差异表达转录本的鉴定和统计，结果如图 1所示。与对照组相比，30 μM cisplation和0.6%KFXY联合处理组共有1 901个差异基因，其中1 555个基因表达上调，346个基因表达下调；30 μM cisplation和0.8%JFJJ联合处理组共有2 587个差异基因，其中2 183个基因表达上调，404个基因表达下调；而30 μM cisplation和100 μg·mL^-1JF联合处理组共有1 488个差异基因，其中1 164个基因表达上调，324个基因表达下调。

2.3 样品差异基因GO注释结果统计

用WEGO进行样品间差异基因GO的分类，样品差异基因GO注释统计结果如图 2所示。3组样品中的差异基因注释到参与的生物过程中最多，差异基因注释到生物过程中的GO主要在细胞内过程(cellular process)、新陈代谢过程(metabolic process)、单一机体过程(single-organism process)、细胞刺激反应(response to stimulus)等，注释到细胞组分的主要在细胞组分(cell part)、细胞(cell)、细胞器(organelle)、细胞膜(membrane)等，注释到分子功能的主要在细胞结合(binding)、催化活性(catalytic activity)、酶调节活性(enzyme regulator activity)、分子转导活性(molecular transducer activity)等。

2.4 样品差异基因KEGG注释结果统计

采用DAVID进行KEGG信号通路富集分析，筛选出25个显著性最高的信号通路。与对照组相比，30 μM cisplatin和0.6%KFXY联合处理组表达上调的差异基因主要富集在p53、系统性红斑狼疮、ECM受体、细胞黏着、细胞凋亡等信号通路；而表达下调的差异基因则主要富集在氨基酰-tRNA生物合成，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸等氨基酸的生物合成，抗生素生物合成，一碳代谢等信号通路(表 2)。与对照组相比，30 μM cisplatin和0.8%JFJJ联合处理组中表达上调的差异基因主要富集在溶酶体、p53、细胞粘附分子、MAPK、细胞凋亡等信号通路；而表达下调的差异基因则富集在核糖体、氨基酸生物合成、氨基酰-tRNA生物合成、一碳代谢等信号通路(表 3)。与对照组相比，30 μM cisplatin和100 μg·mL^-1JF联合处理组中表达上调的差异基因主要富集在p53、吞噬体、ABC转运蛋白、细胞粘附分子、细胞凋亡、MAPK等信号通路；表达下调的差异基因则主要富集在氨基酰-tRNA生物合成、氨基酸生物合成、抗生素生物合成、一碳代谢等信号通路(表 4)。

3 讨论

本研究应用RNA-seq技术分析美洲大蠊提取物联合顺铂处理的结直肠癌细胞内信号通路以及细胞内基因表达的变化。与对照组相比，30 μM cisplatin和0.6%KFXY联合处理组共鉴定出1 555个表达基因上调，346个基因表达下调；30 μM cisplatin和0.8%JFJJ联合处理组鉴定出2 183个基因表达上调，404个基因表达下调；而30 μM cisplatin和100 μg·mL^-1JF联合处理组则鉴定出1 164个基因表达上调，324个基因表达下调。为了明确差异基因的功能，采用WEGO和DAVID进行差异基因的GO和KEGG富集分析。

GO分析结果表明，3组样品中差异基因注释到生物过程中的最多。KEGG分析结果则表明与对照组相比，30 μM cisplatin和美洲大蠊联合处理组中表达上调的基因主要富集在p53、ECM受体、细胞粘附分子、细胞凋亡等信号通路。p53信号通路参与了诱导细胞周期阻滞、促进细胞凋亡和DNA修复等生物过程，发挥着避免受损DNA堆积、维持基因组稳定以及调节细胞分化与衰老等功能活动(Vogelstein et al., 2000)。此外，在结直肠癌中p53信号通路常出现异常(Chen et al., 2006)。最近的研究表明，ECM在肿瘤细胞的转移中发挥着重要的作用，结直肠癌细胞和基质细胞能够通过直接的细胞接触，产生ECM组分和分泌生长因子(Vicente et al., 2013)。细胞粘附分子在结肠直肠癌的转移潜能中发挥重要作用，因此，能够介导这种常见恶性肿瘤的预后效果(Paschos et al., 2009)。值得注意的是，表达上调的基因也富集在ABC转运蛋白家族信号通路，而其中的基因常常在结直肠癌抗药性细胞和肿瘤中高表达(Hlavata et al., 2012)。表达下调的基因主要富集在氨基酰-tRNA生物合成，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢，抗生素生物合成，一碳代谢等信号通路。氨基酰-tRNA生物合成催化相应的氨基酸结合到tRNAs上，这种催化合成反应决定了蛋白质的合成和细胞的存活(Park et al., 2008)，而氨基酰-tRNA生物合成在结直肠癌中却是增加的(Kushner et al., 1976)。最新的研究表明，一碳代谢不仅能够影响癌症的进程，同时也能够影响基因组的完整和表观遗传的改变(Locasale et al., 2013)。因此，监控这些重要信号通路的变化，可以预测美洲大蠊提取物联合顺铂治疗结直肠癌后的预后效果。

综上所述，本文分析了美洲大蠊提取物联合顺铂处理结直肠癌细胞后信号通路的变化。研究结果可为美洲大蠊提取物的深入开发提供丰富的数据资源。

致谢: 本次实验得到四川好医生药业集团的大力支持，在此致以最真诚的谢意！