G蛋白偶联受体是细胞表面受体中最大并最具多样性的家族，其家族成员均具典型7次跨膜结构，介导视觉、嗅觉、行为等众多生理活动(Morris & Malbon，1999)。在人中已发现并获得鉴定的G蛋白偶联受体超过1 000种，约占人类基因总数的5%(Consortium，2004；Zhang et al., 2006)，截至目前，该数量仍在缓慢增加，凸显G蛋白偶联受体在细胞功能实现中的重要作用。

G蛋白偶联受体161(G protein-coupled receptor 161，GPR161)属于G蛋白偶联受体家族孤儿受体家族成员，这一类受体家族成员的内源性配体有待鉴定(Gainetdinov et al., 2004)。尽管缺乏其内源性配体信息，但GPR161被报道在调节晶状体发育和神经胚形成中具有重要作用。空泡化晶状体症小鼠突变体带有先天白内障和神经管畸形，研究发现该表型源于GPR161基因8 bp碱基缺失(Matteson et al., 2008)。原位杂交实验结果进一步显示，GPR161基因的表达伴随着晶状体发育的完整阶段，侧面印证GPR161功能缺失可能是白内障的成因(Matteson et al., 2008)。进一步的研究发现，GPR161的生理功能不仅涉及空泡化晶状体症，还参与调控左右心室形成、乳腺癌细胞的增殖以及垂体柄阻断综合症的发生(Leung et al., 2008；Feigin et al., 2014；Karaca et al., 2014)。

在传统的G蛋白偶联受体信号通路中，胞外配体结合受体激活G蛋白，激活的亚基包括G蛋白α亚基以及β和γ亚基进一步激活下游效应器，包括各种激酶等，促进通路持续(Morris & Malbon，1999)。在信号转导进程中，支架蛋白成为重要的连接器。各种GTP酶、激酶、磷酸化酶等信号蛋白在支架蛋白介导下获得次序激活，掌控多样生理效应。以支架蛋白A类激酶锚定蛋白为例，不同的A类激酶锚定蛋白锚定Ⅰ型或Ⅱ型蛋白激酶A，释放二级信号分子，最终激活环磷酸腺苷感受信号通路(Wong & Scott，2004；Langeberg & Scott，2015)。此外，支架蛋白与G蛋白偶联受体具有物理连接，对G蛋白偶联受体的定位和活性调节有重要意义(Ritter & Hall，2009)。研究表明，GPR161基因除了具G蛋白偶联受体经典的结构特征，其C末端还罕见地包含作为支架蛋白A类激酶锚定蛋白共有的两性分子螺旋，提示该蛋白可以直接锚定、富集Ⅰ型蛋白激酶A，在信号转导进程中发挥更为重要的主导作用，其结构意义及潜在的效应机制备受关注(Mukhopadhyay et al., 2013；Bachmann et al., 2016)。

综上，GPR161基因参与介导机体重要生理效应，其结构特征亦值得进一步探究。至今，针对GPR161基因的研究报道仍然相对匮乏，且GPR161基因序列在鸟类中至今仍未获得鉴定。家鸡Gallus gallus是鸟类模式生物，是脊椎动物进化中最为重要的过渡类群。本研究首次报道家鸡GPR161基因的编码区序列，预测其二级结构，同时也检测其在成体家鸡中的组织表达图谱，研究结果为阐释GPR161基因在脊椎动物中的生理效应提供基础信息。

1 材料与方法 1.1 材料

本实验所用动物为罗曼粉成年家鸡，购自四川牧星养鸡场；引物合成、DNA测序工作由成都擎科公司完成；组织保存和RNA提取所用的RNAzol购自Molecular Research Central；MMLV逆转录酶、dNTP、KOD-Fx高保真聚合酶、Easy-Taq酶、pTA-2载体、限制性内切酶、T4 DNA连接酶均购自大连宝生物工程有限公司(TaKaRa)；分子克隆宿主大肠杆菌Escherichia coli DH5α由本实验室制备保存；荧光定量PCR仪Bio-Rad CFX96、荧光染料Eva Green、96孔板、塑料封膜购自Bio-Rad。

1.2 方法 1.2.1 总RNA提取

取家鸡组织包括脂肪、肾上腺、肾脏、肝脏、肺、肌肉、卵巢、胰腺、皮肤、脾脏、精巢等，迅速放入液氮中速冻，并用研钵研棒保证组织浸泡在液氮中充分研磨成粉末。后续步骤严格按照RNA extraction kits说明书(TaKaRa)提取总RNA：取约60 μg组织粉末，与600 μL RNAzol混合；补充240 μL DEPC灭菌水，用涡旋仪混匀约15 s；在高速冷冻离心机中，于4 ℃、12 000 r·min^-1离心15 min；取上清，加入3 μL阿司咪唑，涡旋15 s后于4 ℃、12 000 r·min^-1冷冻离心10 min；取上清，加入等体积异丙醇，于4 ℃、12 000 r·min^-1冷冻离心10 min；小心吸取上清并弃掉，加入75%乙醇漂洗总RNA沉淀，于4 ℃、8 000 r·min^-1冷冻离心3 min；重复上一步，漂洗RNA沉淀；弃上清，用20 μL DEPC灭菌水溶解沉淀，及时构建cDNA文库或于-80 ℃冰箱保存。

1.2.2 cDNA模板制备

以各组织总RNA为模板进行逆转录构建cDNA文库，具体步骤如下：取2 μg各组织的总RNA样品，与1 μL Oligo-dT混合；补DEPC灭菌水至总体积5 μL (Oligo-dT终浓度为0.5 μg·μL^-1)，混匀；于PCR仪中70 ℃加热10 min后，立即取出放置于冰上10 min；加入2 μL 5×RT buffer，0.5 μL MMLV逆转录酶，0.5 μL dNTPs，补充DEPC灭菌水至总体积10 μL，混匀；于PCR仪中42 ℃反应1.5 h，后又70 ℃反应10 min结束；取反应所得产物加入70 μL灭菌水，所得混合溶液即为cDNA模板。

1.2.3 载体构建

根据Ensemble数据库提供的家鸡基因组信息，遵循引物设计原理并使用DNAMAN 8.0(Lynnon Biosoft)设计家鸡GPR161基因编码区全长引物(上游引物cGPR161-U1和下游引物cGPR161-L1)和组织表达所需的荧光定量引物(上游引物cGPR161-qU1和下游引物cGPR161-qL1)。以家鸡脂肪组织cDNA为模板，使用编码区全长引物对GPR161基因的开放阅读框(ORF)区域进行扩增。PCR扩增体系如下：5 μL 2×KOD缓冲液，2 μL脂肪组织cDNA模板，2 μL dNTPs，上游引物cGPR161-U1和下游引物cGPR161-L1各0.1 μL，0.5 μL KOD-Fx聚合酶，0.3 μL去离子灭菌水。PCR扩增条件如下：94 ℃预变性2 min；98 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，68 ℃延伸2 min，34个循环；72 ℃最后延伸10 min。然后分别取3 μL反应产物，用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果。

取4.5 μL PCR产物与0.5 μL 10×A-attachment Mix混合，置于PCR仪中60 ℃反应30 min，保证KOD-Fx聚合酶扩增的平末端产物的3'末端加上碱基A；反应混合液与pTA-2载体进行4 ℃过夜连接；将连接产物转入DH5α感受态细胞，并均匀涂布在加有抗氨苄的LB固体培养皿中进行蓝白斑筛选；利用pTA-2载体通用引物挑选特异性阳性单克隆，送成都擎科公司进行双向测序。

1.2.4 生物信息分析

对获得的家鸡GPR161氨基酸序列与NCBI数据库中其他物种已知或预测序列，使用DNAMAN 8.0(Lynnon Biosoft)和在线网站ESPript(Easy Sequencing in PostScript)进行氨基酸相似度比对(Robert & Gouet，2014)，分子进化遗传学分析采用最大似然法(Maximum Likelihood，ML)依托MEGA 6.0完成(Tamura et al., 2013)，基因功能预测使用在线BioGRID数据库(Biological General Repository for Interaction Datasets)(Chatr-aryamontri et al., 2016)。

1.2.5 组织表达

采用家鸡不同组织的cDNA模板，以荧光定量PCR方法检测各组织的表达情况。荧光定量PCR的扩增体系如下：2%DMSO，9.5 μL去离子灭菌水，2 μL 10×buffer，6 μL cDNA模板，0.4 μL dNTPs，上游引物cGPR161-qU1和下游引物cGPR161-qL1各0.2 μL，1 μL荧光染料Eva Green，1 μL Easy-Taq酶，总体积为20 μL。荧光定量PCR的扩增条件如下：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性20 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s，39个循环，然后按照0.5 ℃/5 s的速度从70 ℃到95 ℃向上升温熔解，生成熔解曲线。荧光定量PCR的结果按照比较CT值法(2^-ΔΔCT法)进行数据处理(Schmittgen & Livak，2008)，步骤如下：首先将各组织样品结果GPR161的CT值减去对应组织内参基因β-actin的CT值，得到各组织的ΔCT值；然后将GPR161在大脑中的表达量选作参考，并将上一步分别所得的各组织的ΔCT值减去大脑的ΔCT值，得到ΔΔCT值；最后计算2^-ΔΔCT值，得到各组织中GPR161相对大脑中GPR161的表达量倍数，即GPR161在各组织间的相对表达量。

2 结果 2.1 家鸡GPR161基因的克隆

参照NCBI数据库中预测的家鸡GPR161基因序列和Ensemble数据库中的家鸡全基因组设计上、下游PCR引物(表 1)，采用家鸡脂肪组织cDNA为模板，使用高保真酶KOD扩增家鸡GPR161序列。凝胶电泳显示，扩增条带大小与预期一致，略大于1 500 bp(图 1)。将该片段与pTA-2载体连接后转化到DH5α中，经蓝白斑筛选得到阳性单克隆。提取质粒，酶切检验确保重组质粒的完整性后，选取3个单克隆质粒送公司测序。

2.2 家鸡GPR161基因的序列分析

测序结果显示，家鸡GPR161基因编码区ORF长度为1 566 bp，编码521个氨基酸。与家鸡全基因组序列比对后发现，家鸡GPR161基因位于家鸡1号染色体上，编码区没有内含子。将家鸡GPR161基因编码区氨基酸序列与人Homo sapiens、小鼠Mus musculus、斑马鱼Danio rerio的进行比对(图 2)，发现其与人、小鼠、斑马鱼的相似度分别为83.0%、82.6%、65.8%。家鸡GPR161基因含有G蛋白偶联受体的7次跨膜区经典结构，同时还含有支架蛋白A类激酶锚定蛋白的两性分子螺旋结构(图 2)。

2.3 家鸡GPR161基因的分子进化遗传学分析

尽管GPR161基因序列信息目前只在人、小鼠、斑马鱼和家鸡中得到鉴定，但是随着测序技术的发展和越来越多物种的基因组被破译，不同物种中未经实验数据验证的GPR161基因预测序列或片段也能够从Ensemble数据库获得。为了更加全面地探究GPR161基因在不同物种间的分子遗传学进化，分子系统进化树结果显示，家鸡与火鸡Meleagris gallopavo的同源性最高，且与爬行类中华鳖Pelodiscus sinensis、鸟类斑胸草雀Taeniopygia guttata分子进化关系也较为接近，人和小鼠次之，与斑马鱼进化关系则相对较远(图 3)。

2.4 家鸡GPR161基因的功能预测

依托于测序产生的大数据，对某个基因或基因家族的生物信息学进行功能注释，目前已逐渐成为分析和预测基因功能的重要技术。在线BioGRID数据库预测了可能与GPR161基因有蛋白相互作用的基因(图 4)。对蛋白互作网络的GO功能注释分析显示，GPR161主要参与G蛋白偶联受体信号通路、腹侧神经管平滑信号通路的负调控、cAMP生物合成的正调控、初级纤毛的生成等生理功能，比如PPKACA、PPKACB、PPKACG是蛋白激酶A的组成亚基，直接介导cAMP信号。

2.5 家鸡GPR161基因mRNA组织表达分析

为探究GPR161基因在家鸡各组织中的生理学效应差异，以成体家鸡各组织cDNA为模板，用荧光定量PCR方法检测GPR161基因在家鸡各组织中的mRNA水平表达分布情况。各组织的样本数均大于或等于4。结果显示，GPR161基因mRNA在家鸡的精巢或卵巢、大脑、心脏、肌肉中有较高的表达，但在脂肪、肾脏、肺中表达量相对较低，在肝脏、胰腺、皮肤、脾脏中则检测到更弱的表达信号(图 5)。

3 讨论

GPR161基因被报道在晶状体发育、神经胚形成、左右心室形成、乳腺癌细胞增殖、垂体柄阻断综合症的发生等疾病中扮演重要角色(Leung et al., 2008；Matteson et al., 2008；Feigin et al., 2014；Karaca et al., 2014)。该基因在结构上罕见地拥有支架蛋白A类激酶锚定蛋白类似结构，凸显其独特结构特征并暗示其特别的调控机制。本研究首次报道家鸡GPR161基因的序列信息、分子进化关系以及其组织表达图谱。

家鸡GPR161基因编码区ORF长度为1 566 bp，编码521个氨基酸。序列分析显示，家鸡GPR161氨基酸序列与哺乳动物具有较高的序列相似性(人：83.0%；小鼠：82.6%)，而与斑马鱼的相似度相对较低(斑马鱼：65.8%)。分子进化遗传分析表明，GPR161基因在家鸡与火鸡的同源性最高，且与爬行类中华鳖、鸟类斑胸草雀分子进化关系也较为接近，人和小鼠次之，而与斑马鱼进化关系相对较远。

本研究也对GPR161的生理功能做了初步预测。通过在线BioGRID数据库预测了GPR161参与G蛋白偶联受体信号通路、cAMP生物合成的正调控等生理功能，这与目前在初级纤毛的发育等研究报道一致(Mukhopadhyay et al., 2013；Bachmann et al., 2016；Pal et al., 2016)。利用荧光定量PCR分析技术解析获得家鸡GPR161基因组织表达图谱，为探究其在各器官的生理学意义提供了参考依据。家鸡GPR161基因主要在精巢或卵巢、大脑、心脏、肌肉组织中高表达，该研究结果与人、小鼠、斑马鱼的报道基本一致。在人和小鼠的大脑、神经管、垂体等神经系统中，GPR161基因mRNA被检测到高水平表达(Mukhopadhyay et al., 2013；Karaca et al., 2014)。在斑马鱼的胚胎发育中，GPR161基因mRNA的高水平表达信号亦在心脏中被检测到(Leung et al., 2008)。GPR161基因在家鸡大脑与心脏组织中的高表达，暗示该基因在家鸡中很可能介导与哺乳动物和鱼类类似的生理效应，即参与促进神经胚的形成及左右心室的发育等(Leung et al., 2008；Matteson et al., 2008；Li et al., 2015)。与之相对的是，家鸡GPR161基因在肾脏、脂肪、肺中的表达量相对较低，在肝脏、胰腺、皮肤、脾脏中表达信号更弱。本研究结果为阐释GPR161基因在脊椎动物中的生理效应提供了基础信息。