四川动物  2017, Vol. 36 Issue (3): 277-283

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董梦书, 杨琳, 陈祥盛, 张余杰
DONG Mengshu, YANG Lin, CHEN Xiangsheng, ZHANG Yujie
基于线粒体CO Ⅰ基因部分序列的缅甸安小叶蝉地理种群遗传多样性研究
Analysis of Genetic Diversity among Different Geographic Populations of Anaka burmensis (Hemiptera: Cicadellidae) Based on Part of mtDNA CO Ⅰ Gene Sequences
四川动物, 2017, 36(3): 277-283
Sichuan Journal of Zoology, 2017, 36(3): 277-283
10.11984/j.issn.1000-7083.20170026

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收稿日期: 2017-01-21
接受日期: 2017-04-10
基于线粒体CO Ⅰ基因部分序列的缅甸安小叶蝉地理种群遗传多样性研究
董梦书1, 杨琳1,2,3*, 陈祥盛1,2,3, 张余杰1     
1. 贵州大学昆虫研究所, 贵阳 550025
2. 贵州山地农业病虫害重点实验室, 贵阳 550025
3. 贵州昆虫资源开发利用特色重点实验室, 贵阳 550025
摘要: 缅甸安小叶蝉Anaka burmensis是一种取食竹子的害虫,为了探讨该物种不同地理种群的遗传多样性,本研究首次基于线粒体CO Ⅰ基因部分序列对我国26个地理种群共241个样本进行了研究,选取长度为615 bp的基因序列,并运用DNASP、MEGA等分析得出,该片段中有546个保守位点、69个变异位点和33个单倍型。种群的单倍型多样性指数为0.845,核苷酸多样性指数为0.008 77,基因流为0.598 5,种群间的固定系数为0.729 15,表明种群间遗传多样性水平高、遗传分化大、基因交流水平较低。中性检验Tajima's D为-1.658 98,0.10 > P > 0.05,Fu's Fs值为-5.787,P>0.10。分子变异结果显示,该物种遗传变异主要来自种群间,变异百分率为72.92%,而种群内的遗传变异低,仅为27.08%。研究结果得出该物种遗传结构,可为今后从事叶蝉类昆虫的分子生物学研究及该虫的防治提供理论基础资料。
关键词缅甸安小叶蝉     mtDNA CO Ⅰ基因     地理种群     遗传多样性    
Analysis of Genetic Diversity among Different Geographic Populations of Anaka burmensis (Hemiptera: Cicadellidae) Based on Part of mtDNA CO Ⅰ Gene Sequences
DONG Mengshu 1, YANG Lin 1,2,3* , CHEN Xiangsheng 1,2,3, ZHANG Yujie 1     
1. Institute of Entomology, Guizhou University, Guiyang 550025, China;
2. Guizhou Key Laboratory for Plant Pest Management of Mountainous Region, Guiyang 550025, China;
3. Special Key Laboratory of Insect Resource Development and Utilization, Guiyang 550025, China
Abstract: Anaka burmensis is an important pest which feed on bamboo. To investigate the genetic variation of A. burmensis among different geographic populations in China, the 615 bp segments of the mitochondrial cytochrome coxidase subunit Ⅰ (CO Ⅰ) gene of A. burmensis individuals from 26 geographic populations were analyzed by using DNASP, MEGA, etc. The results showed that there were 546 conserved sites, 69 mutation sites, 33 haplotypes in the fragments; a high level of genetic diversity (haplotype diversity index:0.845; nucleotide diversity index:0.008 77) in the total population was detected. Additionally, high genetic differentiation (fixation index:0.729 15) was found among different geographic populations but with low gene flow level (0.598 5). The differences of the Neutral test (Tajima's D=-1.658 98, 0.10 > P > 0.05, Fu's Fs=-5.787, P>0.10) were not significant. The result of molecular variance analysis showed that the genetic differentiation among populations was 72.92% and higher than that of within populations (27.08%). Therefore, here we concluded the genetic structure of A. burmensis can provide a theoretical basis for future research of molecular biology and the control of this insect.
Keywords: Anaka burmensis     mtDNA CO Ⅰ gene     geographic population     genetic diversity    

缅甸安小叶蝉Anaka burmensis隶属于半翅目Hemiptera叶蝉科Cicadellidae小叶蝉亚科Typhlocybinae, 为植食性昆虫, 主要分布于缅甸、越南(Dworakowska, 1993)及中国的贵州、云南、湖南、广西、四川、重庆等地。该虫体长3~4 mm, 体褐色, 中域冠有2个褐色黑圆斑, 前翅前缘与后缘附近各具1淡黄色半透明斑(图 1)。该虫以刺吸竹类植物叶片为生, 严重影响了竹子的生长发育, 是一类重要害虫(杨琳等, 1999陈祥盛等, 2012)。

图 1 缅甸安小叶蝉Anaka burmensis Dworakowska Fig. 1 The phenotype of Anaka burmensis Dworakowska 1.雄成虫背面观male habitus, dorsal view; 2.雄成虫侧面观male habitus, lateral view; 3.头胸部背面观head and thorax, dorsal view; 4.颜面face; 5.头胸部侧面观head and thorax, lateral view。

随着分子生物学技术的迅速发展和广泛应用, 分子标记已成为昆虫分子系统学中的一个新热点(李正西, 沈佐锐, 2002)。在半翅目中, 此研究主要集中在蝽类(卜云等, 2006)、蚜虫(张合彩, 乔格侠, 2008)等。叶蝉类昆虫的研究主要有小贯小绿叶蝉Empoasca onukii(Fu et al., 2014)的地理种群及分子系统学研究。mtDNA是细胞质中一种遗传物质, 呈闭合双链环状结构, 具有简单的分子结构、母系遗传、技术方法简单快捷、比核基因进化速率快、多拷贝及高度保守等特点, 在昆虫系统发育进化(Ren et al., 2013)、遗传变异、亲缘关系和物种鉴定(Lee et al., 2014)等研究领域中应用广泛。在半翅目昆虫中, mtDNA CO Ⅰ基因长度相对其他基因位置比较保守, 用于分子系统学、鉴别物种及遗传变异等研究(肖永刚, 陈祥盛, 2014)。当前有关缅甸安小叶蝉的研究仅局限于形态学和生态学方面, 而在分子生物学上未见地理种群遗传多样性的相关报道。为了解中国缅甸安小叶蝉群体的遗传结构, 本研究通过mtDNA CO Ⅰ基因序列作为分子标记对我国缅甸安小叶蝉26个地理种群的遗传多样性进行研究, 分析其不同地理种群的遗传结构及分化, 探讨其内在的遗传因素, 研究结果有利于深入了解其在中国的分布和变化, 可为叶蝉类昆虫分子生物学研究及缅甸安小叶蝉的防治奠定基础。

1 材料与方法 1.1 材料

供试虫源为2014年10月—2016年8月在国内7个省(市)26个地区通过扫网方法采集的样本(表 1), 将采集的缅甸安小叶蝉成虫置于1.5 mL的离心管中, 分装并记录采集地及时间。用无水乙醇浸泡后, 置于-70 ℃超低温冰箱中保存待用。

表 1 缅甸安小叶蝉不同地理种群样品信息 Table 1 The data of different geographic population of Anaka burmensis
种群代码
Code
采集地点
Locality
采集时间
Collecting date
海拔
Elevation/m
东经
East longitude
北纬
North latitude
样本数量
Number
HX贵州花溪区2015年9月1 108106°40′26°26′10
WD贵州乌当区2015年7月1 008106°50′26°38′10
XW贵州修文县2015年1月1 268106°34′26°50′10
ZZ贵州遵义市2015年1月864106°52′27°38′10
DZ贵州道真县2015年1月902107°34′29°05′10
PD贵州普定县2015年4月1 260105°44′26°18′10
RJ贵州榕江县2016年6月278108°30′25°55′13
CJ贵州从江县2016年7月253108°51′25°43′14
FQ贵州福泉县2014年11月958107°24′26°35′10
LD贵州罗甸县2015年9月678106°32′25°17′2
DX广东韶关市2013年5月93113°44′25°02′1
HN广东广州市2015年1月27113°21′23°11′10
YS广西天峨县2015年7月668110°05′24°08′2
XA广西兴安县2015年7月208110°29′25°52′10
BN云南景洪市2015年9月863101°15′21°56′11
LC云南绿春县2015年9月1 546102°23′23°0′14
ML云南勐腊县2015年5月545101°16′21°56′9
BS云南保山市2016年5月1 16698°50′25°17′10
WS云南文山市2016年6月1 425104°04′23°0′6
LS四川乐山市2016年7月473103°28′29°35′10
YA四川雅安市2016年7月894103°02′29°57′10
YB四川宜宾市2016年7月477104°37′28°47′10
MY四川绵阳市2016年7月482104°36′31°27′10
BB重庆北碚区2016年7月732106°24′29°51′12
FL重庆涪陵区2016年7月516107°23′29°41′10
ZG湖北秭归县2016年8月201110°56′30°45′7

试剂与仪器:昆虫DNA提取试剂盒购于Omega BioTek公司(D0926-01);上海生物工程股份有限公司合成CO Ⅰ引物。Olympus SZ2-ILST型光学体视显微镜(德国Leica公司);T100TM Thermal Cycler型PCR扩增仪(美国BIO-RAD公司);170-8170型UVP凝胶成像系统、Power PacTMHV Power Supply型电泳仪(美国BIO-RAD公司);HVE-50型自动高压灭菌器;Mini-10K微型高速离心机(珠海黑马医学仪器有限公司)等。

1.2 方法 1.2.1 DNA的提取

取出冷冻保存于冰箱的标本, 在解剖镜下去除腹部与双翅置于甘油中保存, 其余的头、胸、足等部分置于灭菌的1.5 mL离心管中并使用研磨棒磨至粉末状, 然后通过E.Z.N.A.TM Insect DNA kit试剂盒提取总DNA, 洗脱出来的DNA用灭菌的PCR管分装, -20 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 PCR扩增及测序

提取的总DNA为模板进行该序列的PCR扩增, 反应程序参照Folmer等(1994), 根据引物设计退火温度(Tm), 设置梯度在10 ℃以内的温度, 进行普通PCR扩增, 琼脂糖凝胶电泳检测得到适合该虫的Tm为50 ℃。扩增引物为CO Ⅰ-F:5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3', CO Ⅰ-R:5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3';PCR扩增反应总体系为30 μL, 上下游引物各1 μL, Taq PCR Master Mix 15 μL, DNA模板3 μL, ddH2O补至30 μL。

PCR扩增程序为:94 ℃预变性3 min;94 ℃变性30 s, 50 ℃退火30 s, 72 ℃延伸1 min, 33~35个循环;最后72 ℃补偿延伸10 min, 4 ℃保存。PCR产物采用1%琼脂糖凝胶电泳检测, 凝胶成像分析系统中观察并拍照, 记录结果。

1.2.3 纯化PCR产物并测序

使用Omega BioTek公司的DNA凝胶回收试剂盒(D0926-01) 对需要纯化的样品PCR产物进行回收, 回收产物存于PCR管中, 由生工生物工程(上海)股份有限公司测序, 用以上引物作PCR扩增, 进行双向测序。

1.2.4 数据的整理、分析

测序得到了241个mtDNA CO Ⅰ基因序列, 将测序结果在NCBI内进行BLAST比对, 确认测序结果为缅甸安小叶蝉的mtDNA CO Ⅰ基因序列;运用DNA Star 5.0拼接和校对所得的序列, 结果选用615 bp序列片段, 对其进行变异分析。

通过MEGA 6.06(Tamura, 2013)分析群体间的碱基组成、变异位点及各核苷酸含量所占的百分比, 分析各群体间的遗传距离、核苷酸相似度、各单倍型间的遗传距离。

用DnaSP 5.10分析群体的核苷酸多样性(Pi)、核酸平均差异度(K)、单倍型多样性(Hd)、中性检验(Tajima's D和Fu's Fs)、基因流(Nst)、遗传分化系数(Gst)、核苷酸平均差异数(Kxy)和核苷酸差异度(Dxy)。种群间的遗传分化程度用固定系数(Fst)衡量(Rousset, 1997), 若Fst<0.25, 表明群体间的基因交流多, 总群体间的遗传分化不明显;若Fst>0.25, 则表明种群间的基因交流少, 有明显的遗传分化在群体中存在(王静等, 2014)。运用Arlequin 3.5.1.2中Genetic structure进行分子变异AMOVA分析;在Network 5.0中用邻接法构建单倍型网络图。

2 结果与分析 2.1 碱基组成及序列分析

获得的615 bp的线粒体序列中有546个保守位点、69个变异位点、51个简约信息位点、18个单一变异位点, 没有碱基的插入与缺失;碱基T、A、G、C的含量分别是45.6%、26.8%、14.8%、12.8%, 其中A+T含量为72.4%, G+C含量为27.6%。

2.2 缅甸安小叶蝉单倍型分析

241个缅甸安小叶蝉样本中共检测出33个单倍型, 分别命名为H1~H33, GenBank登录号为:KY320208~KY320240, 不同地理种群具有不同的单倍型。每个地理种群有1~4个单倍型, 平均有2个单倍型, 其中XW、BN、WS、BS均检测到4个单倍型;HX、WD、ZZ、CJ均检测到3个单倍型。

33个单倍型中有6个共享单倍型(H1、H2、H4、H7、H19和H23), 其中8个种群的76个样本中, H7广泛分布;其次, H2分布在8个种群的47个样本中;H4分布在5个种群的23个样本中;在HX、WD、XW地理种群中4个样本有H1分布;H19分布在BN、ML 2个种群的15个样本中;ML、WS的14个样本中有H23分布。另外有特殊单倍型2个, 分别是H4和H7, 在种群PD、DX、YA、YB、LS、MY、BB和FL样本中出现(表 2)。

表 2 缅甸安小叶蝉不同地理种群单倍型分布 Table 2 Distribution of haplotypes among different geographic populations of Anaka burmensis
种群
Population
单倍型(个体数)
Haplotypes (number of individuals)
单倍型数
Number of haplotypes
单倍型多样性
Haplotype diversity
HXH1(4) H2(47) H3(1)30.511±0.164
WDH1(4) H2(47) H4(23)30.511±0.164
XWH1(4) H2(47) H5(2) H6(1)40.644±0.152
ZZH2(47) H7(76) H8(2)30.511±0.164
DZH7(76) H9(2)20.356±0.159
PDH4(23)10
RJH2(47) H10(12)20.154±0.126
CJH2(47) H11(3) H12(2)30.560±0.125
FQH2(47) H13(4)20.467±0.132
LDH4(23) H14(1)20.500±0.265
DXH4(23)10
HNH2(47) H15(1)20.200±0.154
YSH17(1) H18(1)20
XAH4(23) H16(1)20.200±0.154
BNH19(15) H20(1) H21(1) H22(1)40.491±0.175
LCH23(14) H24(3)20.363±0.130
MLH19(15) H23(14)20.389±0.164
BSH25(5) H26(1) H27(3) H28(1)40.711±0.117
WSH23(14) H29(2) H30(2) H31(1)40.867±0.129
LSH7(76) H13(4)20.200±0.154
YAH7(76)10
YBH7(76)10
MYH7(76)10
BBH7(76)10
FLH7(76)10
ZGH32(5) H33(2)20.476±0.171
总计H1~H33330.845±0.016
2.3 核苷酸多样性与中性检验分析

总群体的Hd为0.845, K为5.392, Pi为0.008 77。不同地理种群Pi为0~0.025 04, Hd为0~0.867, 其中PD、DX、YS、YA、YB、MY、BB、FL种群各项参数最低, 均为0, 而WS种群的Hd=0.867, Pi=0.025 04和K=15.4值最高。中性检验结果显示, 总种群的Tajima's D=-1.658 98, Fu's Fs=-5.787(0.05<P<0.10)。不同地理种群间缅甸安小叶蝉的Kxy的变化范围为0~20.166 7, Dxy的变化范围为0~0.037 5。

用MEGA 6.06采用邻接法在Kimura 2-parameter模型的基础上, 对26个不同地理种群的遗传距离进行分析, 总平均遗传距离为0.016 6, 33个单倍型间的遗传距离为0.001 6~0.049 0。

2.4 不同地理种群的遗传分化

不同地理种群的mtDNA CO Ⅰ基因序列的遗传距离为0~0.039 4。与核苷酸多样性比较结果不显著(P>0.10), 说明遗传分化较低, 推测缅甸安小叶蝉的遗传分化可能受地理位置、海拔和气候的影响。

种群间Fst为0~1, 平均值为0.598 0, 说明分化程度显著;而Gst为0~1, 平均值为0.413;Nst为0~1, 平均值为0.598 5, 各种群间基因流比较均一, 种群间基因交流的水平低, 说明各地理种群可能存在遗传漂变, 从而发生分化。

分子变异AMOVA的结果显示, Fst为0.729 15(表 3), 26个地理种群间的遗传变异百分率为72.92%, 而种群内的仅为27.08%, 表明缅甸安小叶蝉26个地理种群的遗传变异主要在种群间, 而种群内较低。说明部分种群间已经产生了明显的遗传分化。

表 3 缅甸安小叶蝉26个地理种群CO I的分子变异方差分析(AMOVA) Table 3 Analysis of molecular variance (AMOVA) among 26 population of Anaka burmensis
变异来源
Source of variation
自由度
df
平方和
Sum of squares
方差组分
Variance components
变异百分率
Percentage of variation/%
固定系数
Fixation index (Fst)
种群间25486.2092.017 97a72.92
种群内216161.9110.749 59b27.080.729 15
总变异241648.1202.767 56
注:a, b表示在同一水平上, 差异有统计学意义(P<0.05)。
Note:a and b indicate there is a significant difference between populations or within population (P<0.05).
2.5 单倍型网络图、系统发育

用Network 5.0构建单倍型网络图(图 2), 网络图的进化方向比较集中, 可以看成是从中间较多单倍型的种类向周围扩散。在所有群体中具有较高频率的几种单倍型位于网络进化图的右方, 其余低频率的单倍型则通过短支与这几种高频率的单倍型相连, 呈现从频率高向低处扩散的现象。H2、H4、H7所占的样本量多, 频率较高, 同时其他的单倍型也存在独立的分支, 与分子变异方差分析结果吻合, 说明种群间的遗传分化来自于种群间, 该物种可能存在种群变异。

图 2 缅甸安小叶蝉CO Ⅰ基因单倍型网络中介图 Fig. 2 Median-joining network of haplotypes of Anaka burmensis based on CO Ⅰ gene 黄色圆面积代表单倍型出现频率, 红色数字代表变异位点, 红色圆点代表中值矢量;圆面积的大小表示样本量的多少, 其中最小为1个样本量(如H3、H6、H14等), 最大为76个样本量(如H7)。 Yellow circle area represents haplotype frequencies, red number represents variable sites, and red dot represents median vectors; the size of the circle area indicates the number of samples (1-76).
3 讨论

本研究以我国26个地理种群的缅甸安小叶蝉冷冻标本为材料, 探索了该虫241个个体的mtDNA CO Ⅰ基因序列, 进行了测定、分析, 并构建了网络图。其中, 72.4%的A+T含量显示碱基A+T偏向性, 与半翅目昆虫线粒体基因序列碱基组成结果一致, 如绿环缘蝽Stictopleurus subviridis A+T含量达到75.7%(花吉蒙等, 2009), 五节根蚜亚科Fordinae的平均A+T含量为79.6%(张合彩, 乔格侠, 2008), 17种菱蜡蝉亚科Cixiinae的平均A+T含量为67.2%(肖永刚, 陈祥盛, 2014), 假眼小绿叶蝉Empoasca vitis的A+T含量为70.2%(付建玉等, 2014);也与其他昆虫的一致, 如直翅目黄胫小车蝗Oedaleus infernalis的为67.91%(孙嵬等, 2013)。

用不同地理种群缅甸安小叶蝉作为实验材料, 亲缘关系近, 且变异中转换值大于颠换值, 符合亲缘关系相近的分类阶元中核苷酸的转换大于颠换的规律, 在远缘分类阶元中恰恰相反(Simon et al., 1994)。本研究共得到33个单倍型, 其中H7个体数量为76, 占总数的31.5%, 说明其可能为该物种种群的原始单倍型, 具有这种单倍型的物种适应环境的能力强, 在生存中为优势种。所有单倍型中共享单倍型有6个, 特殊单倍型2个。XW、BN、WS、BS 4个种群的单倍型种类最多, 均为4个, 其次为HX、WD、ZZ、CJ, 均为3个, PD、DX、YA、YB、LS、MY、BB和FL均为1个。单倍型的种类也映射出群体来源的复杂性, 说明XW、BN、WS、BS、HX、WD、ZZ、CJ的遗传多样性高, 有丰富的遗传资源, 而PD、DX、YA、YB、LS、MY、BB和FL的遗传多样性较低。群体单倍型多样性高, 说明遗传资源丰富, 遗传多样性高。本研究的单倍型多样性为0.845, 说明缅甸安小叶蝉不同地理种群的遗传多样性程度较高, 存在遗传分化。特别是在BN和WS地理种群中, 单倍型多样性最高, KxyDxy的值比其他种群大, 推测不同的地理种群所处的自然环境不同, 在寄主植物和自然环境的选择下, 发生了相对较大的遗传结构变异。

中性检验结果Tajima's D和Fu's Fs可反映种群数量的历史变化。两项中性检验的结果参数为负值, P>0.01, 说明我国缅甸安小叶蝉在近段历史时期有种群扩张, 产生了稀有的等位基因(检测到低频率的单倍型), Fu's Fs为负值, 表明近段时期该虫可能经历了种群爆发与扩张事件(Tajima, 1989), 近期内有向某一方向迁飞的趋势。所有地理种群无显著差异, 说明各地理种群进化符合中性模型(王兴亚, 许国庆, 2014)。

在单倍型的发生频率和组成的基础上, 通过分子变异AMOVA分析不同地理种群的分化程度和差异, 来判断种群间遗传分化。分子变异结果表明, 缅甸安小叶蝉的遗传变异主要来自种群间, 种群内分化少, 说明存在种群扩张, 其Fst值为0.729 15, 说明种群间的遗传分化显著。在这过程中就有着种群间的基因交流, 基因流影响种群间的分化, 减少种群间的遗传差异, 研究结果表明, 基因流Nst值为0.598 5, 小于1, 说明种群内部基因交流水平低, 各种群间可能发生遗传漂变, 而迁飞发生基因交流较少, 可能存在自然选择、地理环境的影响, 发生了遗传变异(Boivin et al., 2004)。

由单倍型网络可看出, H7、H22分别是8个不同地理种群的共享单倍型, 不同的单倍型存在于不同种群中, 单倍型中介网络图分布的地理种群间对应关系不明显, 说明部分地理种群的缅甸安小叶蝉可能存在不同程度的扩张。从分布格局上看, 比较混乱, 即存在地理种群间的遗传分化, 种群内部分化小, 但从分析结果看, 造成分化的原因有地理隔离, 也可能是地理位置、海拔和气候自然选择的结果。

我国缅甸安小叶蝉栖息地无明显丢失现象, 可能是自然环境或地理隔离阻碍了其基因交流。不同地理种群间遗传变异和分化有差异, 部分地理种群间存在迁飞或者扩散现象, 都是自然选择的结果;各地理种群内的基因交流较小, 遗传分化较小, 内部遗传变异较低。本研究在一定程度上为缅甸安小叶蝉的系统进化研究, 进一步揭示该虫的起源、分化格局、发生规律及扩散方向, 也为将来不同地理种群叶蝉类害虫的防治提供了分子水平的基础资料。由于时间以及该物种生活史的影响, 本研究的不足之处在于仅在我国竹子主产区采集样本, 且仅通过mtDNA CO Ⅰ部分序列来研究分析了缅甸安小叶蝉系统进化, 因此, 未来应完善样品采集地以及扩大不同地理种群的样本量, 用序列的全长或更多基因进行分子标记, 得到更精确的数据。

致谢: 感谢杨琳老师和陈祥盛教授在实验过程中给予的指导和帮助, 感谢贵州大学昆虫研究所的所有老师在平时答疑中给予的指导, 感谢贵州大学昆虫研究所张余杰、罗强、姚亚林等在标本采集及数据分析上的帮助。
参考文献
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