阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)导致患者进行性的学习记忆能力下降与脑内胆碱能递质系统功能的减弱有关(Ballard et al., 1995；Karran et al., 2011)。动物长期小剂量注射D-半乳糖(D-galactose，D-Gal)联合AlCl₃灌胃的方法近年来常被应用于建立衰老和脑老化的动物模型(Xiao et al., 2011；Yang et al., 2013)。采用该方法建立的模型小鼠出现了胆碱能神经元及其他神经元不同程度的丢失，学习记忆能力减退，脑组织出现β-淀粉样蛋白(β-amyloid protein，Aβ)沉积并有老年斑(senile plaques，Sp)和神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFT)形成，能较成功地模拟AD发病及其病理特征(Xiao et al., 2011；Yang et al., 2013)。

随着全球人口老龄化，AD引起的老年痴呆症患者发病率逐年升高，成为影响老年人生活质量的主要疾病之一。研究证实，AD患者伴有脑中多种神经递质的紊乱，包括乙酰胆碱(acetylcholine，ACh)系统、单胺系统和氨基酸类神经递质，其中以ACh的减少最为突出，AD患者的痴呆程度与新皮质和海马中ACh缺失程度密切相关(Auld et al., 2002；Orgogozo et al., 2002)。在AD患者脑内，胆碱能神经元明显丧失，胆碱能神经纤维发生退行性改变，胆碱乙酰转移酶(choline acetyl transferase，ChAT)和乙酰胆碱酯酶(acetylcholine esterase，AChE)异常表达。同时，AD患者脑内ACh的作用位点，烟碱型乙酰胆碱受体和毒蕈碱型乙酰胆碱受体在与学习和记忆密切相关的大脑皮层和海马明显减少(Auld et al., 2002；Orgogozo et al., 2002；Li et al., 2012)。目前，胆碱能假说已成为AD发病机制中最重要的假说之一，对AD的治疗有一定指导意义。

何首乌Polygonum multiflorum Thunb.是蓼科Polygonaceae何首乌属Polygonum多年生缠绕藤本植物，有补肝益肾功效，可通过“补肾”而“生髓”“健脑”，用于增加老年性痴呆患者的记忆功能。研究报道以何首乌为主药的复方口服液对老年痴呆小鼠模型有明显的治疗效果，能够降低AChE活性(马允等，2005)。何首乌的主要有效活性成分为2，3，5，4-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(THSG)，也叫何首乌苷(Polygonum multiflorum Thunb. glycoside，PM)，其含量高且药理活性明确(梅雪等，2016)。THSG对多种脑损伤动物模型的学习记忆障碍有一定的改善作用，同时具有抗氧化、清除自由基的功能(张兰等，2004)，并能促进Aβ_25-31诱导神经干细胞向神经元定向分化(张玉莲等，2014)。前期在细胞水平的研究工作也揭示了THSG通过凋亡相关信号通路的蛋白分子来拮抗星形孢菌素所致的神经元毒性损伤(Yang et al., 2014)。本实验采用AlCl₃灌胃和D-Gal皮下注射建立亚急性衰老小鼠模型，进一步探讨了PM对亚急性衰老模型小鼠学习记忆能力和胆碱酯酶系统的影响，为PM的开发利用提供理论基础。

3月龄健康KM小鼠72只，雌雄各半，体质量34.06 g±5.15 g，购自北京市海淀区温泉幸运饲养场，生产许可证号：SCXK-(军)-2012-0004，使用许可证号：SCXK-(军)-2012-0047。所有小鼠于清洁级动物室饲养，自由饮食，室内温度20~25 ℃，相对湿度60%~80%，保持通风，定时换气，每日光照/黑暗更替周期为12 h。

PM购自北京欣科中晶生物科技有限公司，货号：C20H2209，纯度＞98%。

AlCl₃、NaCl、D-Gal、雌二醇(estradiol，ED)均购自北京博扬宏达科技有限公司产品，货号分别为：20140528、1104253、C2312-1、C2312-2；兔抗人ChAT抗体(rabbit，产品编号：TDY042F)、兔抗人AChE抗体(rabbit，产品编号：TDY048E)，均为Santa Cruz Biotechnology产品；鼠抗人Actin抗体(mouse，货号：A5316)，为Sigma产品；山羊抗小鼠IgG (产品编号：MD161)、山羊抗兔IgG (产品编号：MD162)，为Cell Signaling产品；辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG (产品编号：H1211)，为Santa Cruz Biotechnology产品；组织裂解液、Tween-20为上海碧云天生物技术有限公司产品，货号：T8200、922C042。

YLS-3TB型跳台记录仪(北京微信斯达科技发展有限责任公司)；化学发光成像仪Tanon 4200(上海天能公司)；DYY-TC型电泳仪(北京六一厂)；恒温水浴锅(北京长风仪器仪表厂)；高速冷冻离心机5417R (德国Eppendodf公司)；低速常温离心机TDL-40B (上海安亭公司)；TI-21半干法转膜仪(美国Hoefer公司)等。

参考相关文献(Xiao et al., 2011；王昱等，2015)构建亚急性衰老小鼠模型。筛选60只KM小鼠并随机分为正常对照组、衰老模型组、ED阳性对照组(ED剂量为10 mg·kg^-1)、何首乌苷高、中、低剂量组(H-PM、M-PM、L-PM组剂量分别为：80 mg·kg^-1、40 mg·kg^-1、20 mg·kg^-1)，雌雄各半。除正常对照组外，各实验组每天接受AlCl₃(10 mg·kg^-1)灌胃及D-Gal (120 mg·kg^-1)颈部皮下注射，持续处理60 d；正常对照组每天接受等量蒸馏水灌胃及生理盐水颈部皮下注射，持续处理60 d。通过跳台行为学实验筛选造模结果为阳性的小鼠：以正常对照组小鼠跳台回避错误次数的均值为参考值，用衰老模型组的跳台回避错误次数判断小鼠造模结果，跳台回避错误次数＞正常对照组小鼠跳台回避错误次数均值的20%即造模成功。

采用跳台行为学实验(王昱等，2015)对衰老模型组和正常对照组小鼠进行训练，根据跳台回避错误次数的实验数据判断各组小鼠学习记忆能力的变化和差异。将小鼠放入反应箱内适应3 min，然后通以0.6 mA，30 V交流电流，小鼠受到电击后将寻找跳台以躲避电击。记录各组小鼠5 min内从跳台跳下的错误次数。次日用学习完成的小鼠再次进行跳台测试，根据2次跳台回避错误次数的实验数据分析各组小鼠的记忆保持能力。

给药组小鼠在造模后15 d起分别颈部皮下注射高、中、低剂量的PM和ED，注射标准为0.1 mL/10 g，持续给药15 d；正常对照组和衰老模型组小鼠注射等量生理盐水，持续处理15 d。给药后采用行为学实验检测小鼠学习记忆能力的变化。

跳台行为学检测后，颈椎脱臼法处死小鼠，快速取海马体，分别保存于3 mL EP管中，-20 ℃暂存。在冰上用细胞裂解液(质量体积比W/V=1: 9)分别将小鼠海马体组织研磨，冰上裂解30 min后，4 ℃13 000 r·min^-1离心25 min，取上清，暂存于-20 ℃，用于Western Blot实验。

Western Blot法如前期工作文献(Yang et al., 2014)描述。用BCA法测定蛋白浓度，对提取的海马组织总蛋白进行蛋白定量。将每个样品的蛋白浓度调成一致，用10%的SDS-PAGE分离蛋白质，半干法转膜(PVDF膜)，5%的奶粉封闭液封闭30 min，一抗(1: 1 000)孵育过夜(4 ℃)，TBST洗3~5次，每次10 min，室温下二抗(1: 2 000)孵育1 h，TBST洗3~5次，每次10 min。加化学发光液后在化学发光成像仪Tanon 4200中检测目的蛋白质的表达量并拍照。实验结果以实验组目的蛋白灰度值与正常对照组β-actin灰度值的比值进行统计分析。

实验数据采用GraphPad Prism 5.0进行方差分析及独立性t检验，数据结果均采用x±s表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

与正常对照组相比，各实验组小鼠跳台实验回避错误次数显著增加(P＜0.001)。AlCl₃灌胃和D-Gal皮下注射引起了小鼠的学习记忆能力的障碍，表明亚急性衰老模型小鼠造模成功(图 1)。

图 1 正常对照组与实验组小鼠跳台回避错误次数 Fig. 1 The number of avoidance errors of control and treatment groups ###实验组小鼠回避错误次数极显著高于正常对照组，P＜0.001。 ### compared with control group, the number of avoidance errors of treatment group is extreme significantly different, P < 0.001.

图选项

跳台实验结果显示：与正常对照组比较，衰老模型组小鼠的跳台回避错误次数明显增加(P＜0.05)；与衰老模型组比较，ED阳性对照组和H-PM组、M-PM组、L-PM组的跳台回避错误次数明显减少(P＜0.05或P＜0.001)，而H-PM组、M-PM组和L-PM组与ED阳性对照组的跳台回避错误次数相近(P＞0.05)，说明PM能够改善亚急性衰老模型小鼠的学习记忆能力障碍(表 1)。

与正常对照组相比，衰老模型组小鼠海马体组织细胞内ChAT的表达量极显著下降(P＜0.001)。给药后，M-PM组、H-PM组与ED阳性对照组较衰老模型组ChAT的表达量明显上升，差异有高度统计学意义(P＜0.01或P＜0.001)；L-PM组与衰老模型组的差异无统计学意义。说明亚急性衰老模型小鼠海马体组织细胞ChAT表达量明显下降，而中、高剂量的PM能够恢复海马体ChAT的活性，促进胆碱能神经元合成ACh，从而改善胆碱能系统(图 2)。

图 2 Western Blot检测各组小鼠海马组织ChAT的表达量 Fig. 2 The expression of ChAT in mice hippocampus tissue as determined by Western Blot 与正常对照组比较，*** P＜0.001；与衰老模型组比较，# P＜0.05，## P＜0.01，### P＜0.001；n=3；下同。 Compared with the control group, ***P < 0.001; compared with the model group, # P < 0.05, ## P < 0.01, ### P < 0.001; n=3; the same below.

图选项

与正常对照组相比，衰老模型组小鼠海马体组织细胞内AChE的表达量极显著增加(P＜0.001)；给药后，L-PM组、M-PM组、H-PM组与ED阳性对照组较衰老模型组AChE的表达量明显减少，差异有统计学意义或高度统计学意义(P＜0.05，P＜0.01或P＜0.001)。说明亚急性衰老模型小鼠海马体组织细胞AChE表达量明显上升，ACh破坏显著，而PM能够抑制AChE的活性，减少ACh的破坏，改善胆碱能系统损害(图 3)。

图 3 Western Blot检测各组小鼠海马组织AChE的表达量 Fig. 3 The expression of AChE in mice hippocampus tissue as determined by Western Blot

图选项

由于老年痴呆症的病因、发病机理未明，尚无根治药物。研究发现老年痴呆症患者大脑有大量的铝沉积，含量是正常人的数倍，并能引起大脑神经纤维病变、胆碱能神经系统功能障碍，因此推测铝与老年痴呆症的发病密切相关，也成为老年痴呆发病的重要发病机制之一。为此提出老年痴呆症的铝中毒学说，用铝(如AlCl₃)来复制老年痴呆症的病理模型(马允等，2005；王昱等，2015)。D-Gal可造成小鼠亚急性衰老早有报导(孙荣花等，2015)。动物长期注射D-Gal后，由于代谢产物半乳糖醇不能被进一步代谢而堆积在细胞内，导致细胞代谢紊乱，活性氧增多和细胞膜脂质受损，以致机体多器官、多系统功能衰退，这些现象均与老龄化非常相似。

D-Gal联合AlCl₃造成小鼠亚急性衰老，引起神经元的一系列退行性改变，包括神经元数量减少、超氧化物歧化酶活性下降、丙二醛和脂褐素水平升高、脑内ACh含量明显下降、ChAT表达下降(Xiao et al., 2011；王昱等，2015)。故本实验选择了AlCl₃灌胃联合D-Gal颈部皮下注射60 d的处理来建立亚急性衰老小鼠模型，以模拟老年痴呆症的病理模型，并通过跳台逃避行为学实验来验证造模是否成功。实验结果显示，实验组学习记忆能力较正常对照组明显下降，说明模型建立成功。治疗后，各给药组与衰老模型组比较学习记忆能力明显改善，表明PM与ED具有相同的抗衰老功能，可改善亚急性衰老模型小鼠的学习记忆能力。

另一方面，本研究发现D-Gal联合AlCl₃方法建模成功的疾病模型动物，治疗前和治疗结束后的跳台回避错误次数出现了较大的组间差异。D-Gal联合AlCl₃建模方法虽然是目前普遍使用的一种方法，但是该方法的有效性和持久性可能还存在一定的局限性。实验结束后，除各给药组外，对照组小鼠的跳台回避错误次数也出现了显著的组间差异，提示可能是小鼠在中断D-Gal和AlCl₃处理后机体对神经组织的损伤进行了自身修复或者是小鼠对刺激产生了记忆。对于上述推测，本课题组将会设计实验进一步验证，探究D-Gal联合AlCl₃造模方法的局限性和改进方式。

大脑学习记忆和认知能力与胆碱能神经系统密切相关，ACh是此系统重要的神经传导介质，它由ChAT催化合成，释放后作用于AChRs，之后被AChE催化分解。多数研究表明，AD患者新皮质和海马区域中ChAT表达或活性明显减低，而AChE表达或活性升高，造成ACh含量明显下降，使学习记忆、认知能力减退，且与认知障碍程度密切相关(Ikonomovic et al., 2007；Karran et al., 2011；Li et al., 2012；仇淑君等，2014)。因此检测AD小鼠模型海马组织内ChAT和AChE含量，可以评估中枢胆碱能系统的损害情况。实验结果显示，亚急性衰老模型小鼠海马体组织细胞内ChAT明显降低而AChE含量显著上升。药物干预后，AChE含量显著下降而ChAT明显升高，表明PM能够提高ChAT的表达而抑制AChE的活性，恢复海马体胆碱能神经元内合成酶的表达和活性，促进胆碱能神经元的修复，从而改善学习记忆和认知能力。

综上所述, PM可改善D-Gal联合AlCl₃造模形成的亚急性衰老模型小鼠的学习记忆能力，并显著升高脑内ChAT含量、降低AChE水平，恢复ACh含量，这可能是防治AD的机制之一。