动物在野外生存面临许多环境因子的胁迫，尤其是在冬季，如环境温度较低和食物资源较差(Voltura & Wunder，1998)。当环境温度较低时，小型哺乳动物会表现出生理、行为等方面的适应性特征变化(Feder & Block，1991)，而这往往会影响其野外的生存策略(朱万龙等，2008)。生理上，小型哺乳动物通常会在低温环境下增加产热能力，其主要的适应性产热(非颤抖性产热)发生器官是褐色脂肪组织(brown adipose tissue，BAT)。已有研究表明：低温条件下小型哺乳动物的白色脂肪组织(white adipose tissue，WAT)可以褐变，进而向BAT转化(Cypess et al., 2009；van Marken Lichtenbelt et al., 2009；Enerback，2010；Birerdinc et al., 2013)，从而提高其产热能力。其中几种重要的脂肪转化因子起着重要的作用，如COXⅡ和PGC-1α能诱导WAT中BAT细胞的形成(Gesta et al., 2007；Madsen et al., 2010；Vegiopoulos et al., 2010)，PPARα能诱导原代BAT细胞和BAT中解偶联蛋白1(uncoupling protein 1，UCP1)的表达(Feder & Block，1991)。这3种转录因子在冷驯化条件下表达量上调，可以使WAT褐变向BAT转化，从而增加动物的产热能力(Birerdinc et al., 2013)。

中缅树鼩Tupaia belangeri主要栖息在热带、亚热带地区，为东洋界特有的小型哺乳动物。研究表明树鼩科Tupaiidae动物由南向北扩散，即支持“岛屿起源”假说(Olson et al., 2005)，而本研究组之前的研究也支持这一假说(王政昆等, 1994, 1995, 1999；张武先等，2002)。目前，实验动物的研发趋向动物体型小型化发展，树鼩因体型较小(一般为80~150 g)、进化地位和灵长类相似、人工繁殖和饲养成本较低，近年来已被广泛用作生物、医学等科学研究的实验动物(Kawamichi & Kawamichi，1979)。本研究组先前的研究结果指出，中缅树鼩在冷驯化条件下的产热、BAT质量和UCP1含量显著增加(王政昆等，1995)，那么在该环境下中缅树鼩的WAT是否会向BAT转化，导致BAT质量和UCP1含量增加，从而增加其产热能力？本研究在此假设的基础上，在冷驯化条件下测定中缅树鼩的脂肪组织质量，脂肪转录因子PPARα、COX Ⅱ及PGC-1α基因表达量，来验证低温条件下中缅树鼩的WAT是否会褐变，进而向BAT转化。

1 材料与方法 1.1 动物来源

中缅树鼩捕自云南省昆明市禄劝县的灌丛中，于云南师范大学生命科学学院动物饲养房(昆明)单笼室温饲养(温度25 ℃±1 ℃，光照12L:12D)。饲料为标准的雏鸡饲料(昆明生产的产蛋雏鸡饲料)，熟喂，自由饮水。实验动物均为成年非繁殖期个体。

1.2 动物处理

预适应1周后进行正式实验，随机分成2组：对照组和冷驯化组(每组各10只)，实验前，2组动物体质量差异无统计学意义。冷驯化组在温度5 ℃±1 ℃，光照12L:12D环境中驯化28 d；对照组在温度25 ℃±1 ℃，光照12L:12D环境中驯化28 d。驯化期间动物可以自由取食和饮水。2组动物于28 d后断颈处死，称量其大网膜WAT和肩胛骨间BAT质量，取出皮下WAT于-80 ℃保存，用于相关脂肪转录因子基因表达量的测定。

1.3 表达量测定 1.3.1 RNA提取及纯度鉴定

皮下脂肪组织总RNA的提取与纯化根据RNApure高纯总RNA快速抽提试剂盒(BioTeke Co.)提供的方法进行。通过琼脂糖凝胶电泳进行RNA纯度和完整性检验。提取的总RNA置于-80 ℃保存。

1.3.2 cDNA第一链合成

第一链的合成以皮下脂肪组织总RNA为模板，根据FastQuant RT Kit (With gDNase)试剂盒提供的方法进行。基因组DNA的去除体系包括：2 μL 5×gDNA Buffer，4 μL总RNA，4 μL Rnase-Free ddH₂O，配制体积10 μL，混匀。离心，42 ℃孵育3 min。然后置于冰上。反转录反应体系包括：2 μL 10×Fast RT Buffer，1 μL RT Enzyme Mix，2 μL FQ-RT Primer Mix，5 μL Rnase-Free ddH₂O，配制体积10 μL。将反转录反应中的Mix加到gDNA去除步骤的反应液中，充分混匀。42 ℃孵育15 min，95 ℃孵育3 min之后放于冰上，得到的cDNA低温保存。

1.3.3 PPARα、COXⅡ及PGC-1α基因cDNA序列的扩增

根据已知脊椎动物PPARα、COXⅡ及PGC-1α基因氨基酸保守序列设计引物(表 1)(章迪等，2014)。以上述cDNA第一链为模板进行RT-PCR，扩增条件均为：95 ℃变性4 min；95 ℃ 30 s，54~56 ℃ 1 min，72 ℃ 40 s，37个循环；72 ℃延伸10 min。扩增体系为50 μL：1 μL模板(10 ng·μL^-1)，1 μL上游引物(10 pmol·μL^-1)，1 μL下游引物(10 pmol·μL^-1)，4 μL dNTP (10 mmol·L^-1，pH8.0)，1 μL Taq酶(4 U·μL^-1)，5 μL 10×PCR Buffer (Mg²⁺)，37 μL ddH₂O。扩增产物效果见图 1。

1.3.4 实时荧光定量PCR (FQ-PCR)

模板cDNA用ABI-7000^TM实时荧光PCR仪进行扩增，同时检测荧光信号。FQ-PCR反应体系依照SYBR Green Realmaster Mix试剂盒说明进行配制。反应体系为20 μL：9 μL SYBR Green Realmaster Mix，0.5 μL F引物(12.5 μmol·L^-1)，0.5 μL R引物(12.5 μmol·L^-1)，0.5 μL cDNA模板，9.5 μL RNase ddH₂O。扩增条件为第一步94 ℃ 2 min，第二步94 ℃ 15 s，第三步60 ℃ 35 s，第二步到第三步重复37个循环。1个基因的每个样本均进行3次实时荧光定量平行重复，采用的数据为3次平行测定结果的平均值(朱万龙等，2014)。内参基因引物F：5’-GAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3’；引物R：5’-CATCTGCTGGAAGGTGGACA-3’。

1.3.5 2^-ΔΔCT相对定量法

目的基因的转录表达水平采用2^-ΔΔCT相对定量法进行计算，用内参基因作均一化处理，ΔΔCT=(CT_目的基因-CT_内参基因)_处理组-(CT_目的基因-CT_内参基因)_对照组，2^-ΔΔCT可反映出用内参基因均一化处理后，该样本目的基因的初始模板量相对于对照样本的表达倍数(差异)(Livak & Schmittgen，2001；Crott et al., 2007；Ornatowska et al., 2007)。对于对照组样本，ΔΔCT=0，2^-ΔΔCT=1。而对于冷驯化组样本，若2^-ΔΔCT＞，说明该基因表达上调；若2^-ΔΔCT＜1，说明该基因表达下调。

1.4 统计分析

实验数据的统计分析采用SPSS 16.0处理。采用独立样本t检验对不同组中WAT、BAT质量和相关脂肪转化因子表达量的差异进行处理。结果以平均值±标准误(Mean±SE)表示，其中P＜0.05表示差异有统计学意义，P＜0.01表示差异有高度统计学意义。

2 结果

实验前，对照组和冷驯化组中缅树鼩的体质量分别为103.56 g±2.32 g和102.89 g±3.02 g，2组体质量差异无统计学意义(P＞0.05)。冷驯化28 d后，2组脂肪组织质量差异有高度统计学意义(BAT：t=-6.92，P＜0.01，图 2；WAT：t=-5.56，P＜0.01，图 3)，冷驯化组显著高于对照组，其中BAT质量为冷驯化组较对照组升高了85.71%，WAT质量则增加了14.14%。

冷驯化28 d后，中缅树鼩PPARα、COXⅡ和PGC-1α基因表达量显著高于对照组(PPARα：t=-6.36，P＜0.01，图 4：A；COXⅡ：t=-7.44，P＜0.01，图 4：B；PGC-1α：t=-2.87，P＜0.01，图 4：C)，其中冷驯化组PPARα、COXⅡ和PGC-1α基因表达量分别是对照组的7.68倍、5.65倍和9.98倍。

3 讨论

栖息环境不同，小型哺乳动物在低温条件下的体质量变化模式也不同，有些动物体质量变化不明显，如小林姬鼠Apodemus sylvaticus(Klaus et al., 1988)和非洲刺毛鼠Acomys cahirinus(Khokhlova et al., 2001)，而有些动物体质量增加，如环颈旅鼠Dicrostonyx groenlandicus和金黄仓鼠Mesocricetus auratus(Nagy & Negus，1993)。在本研究中，冷驯化组中缅树鼩大网膜WAT质量显著增加，和本研究组之前研究结果中中缅树鼩的体质量变化趋势一致，说明在冷驯化过程中，中缅树鼩体质量的增加可能和体内WAT质量的增加有关，当然，WAT的增加也和动物在该驯化条件下食物充足、不受限制有关(王政昆等，1995)。动物在低温条件下，一般会增加其产热能力来维持生存(Hayes & Chappell，1986)。本研究中，中缅树鼩在冷驯化条件下，BAT质量较对照组显著增加，说明中缅树鼩在该条件下增加BAT质量，从而增加UCP1的含量，最终增加非颤抖性产热来应对低温胁迫，这和本研究组先前的研究结果一致(Zhu et al., 2012)。BAT的质量增加可能是中缅树鼩自身在冷驯化条件下的BAT增生，还有可能是WAT褐变向BAT的转化而来。

脂肪转化因子PPARα、COXⅡ及PGC-1α在WAT向BAT的转变中具有重要作用(Madsen et al., 2010)。PPARα表达量的上调能诱导原代BAT细胞增生和UCP1的高表达(Barbera et al., 2001；Tong et al., 2005)。COXⅡ对于WAT中诱导形成BAT细胞是必需的，有研究表明WAT中诱导出现的BAT细胞中UCP1的表达依赖于COXⅡ(Madsen et al., 2010)。PGC-1α表达过高会使小鼠Mus musculus的WAT中具有UCP1阳性表达的BAT细胞增加(Puigserver et al., 1998)。本研究中，冷驯化28 d后，PPARα mRNA、COXⅡ mRNA及PGC-1α mRNA的基因表达量显著增加，这可能诱导了中缅树鼩WAT中BAT细胞的形成，或者使脂肪组织中UCP1含量增加，从而增加其在冷环境中的产热能力。

总之，中缅树鼩在冷驯化条件下通过增加脂肪转录因子的基因表达量，可能使得WAT细胞褐变增加UCP1表达量，促进了BAT细胞的分化和代谢，弥补中缅树鼩在冷环境中适应性产热的不足，以抵抗低温环境。