布氏田鼠 Lasiopodomys brandtii 隶属于啮齿目Rodentia仓鼠科Cricetidae田鼠亚科Microtinae，是半干旱型草原的主要啮齿类动物，分布在我国内蒙古中、东部，蒙古利亚共和国南部、东方艾玛格省东部以及俄罗斯(Shenbrot & Krasnov，2005)。在我国主要有2个间断的分布区，分属于内蒙古的呼伦贝尔草原和锡林郭勒的典型草原地区。近年来人类活动和气候变化破坏了草原生态系统，导致大面积荒漠的出现，形成了动物迁徙和重新分布的地理阻隔，使布氏田鼠种群呈点状、片段化、间断性分布(Zhong et al .，1985；Shi，1988；王万杰，任伯平，2007)。进化生物学和群体遗传学理论表明，小的和孤立的种群将受到扩散的限制并导致遗传多样性降低，甚至因随机漂移和近亲繁殖的综合影响而丧失遗传变异(Frankham，2005)。Wang等(2011)基于微卫星标记对内蒙古东乌珠穆沁旗、阿巴嘎旗、新巴尔虎左旗和正镶白旗4个布氏田鼠地理种群遗传多样性分析显示，不同种群间等位基因平均数、有效等位基因平均数、信息指数、有效等位基因数和平均期望杂合度之间无显著差异，各种群内平均观测杂合度小于平均期望杂合度，4个种群28个位点中有14个位点背离Hardy-Weinberg平衡。结果表明布氏田鼠遗传变异主要发生在种群内，其中正镶白旗种群存在近交现象，遗传多样性最低。

分子标记技术为研究种内不同种群形成现有地理分布格局的历史原因和演化过程提供了有效的途径(Avise et al .，1998)。主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)是脊椎动物体内与免疫应答调节密切相关的一个基因家族，由紧 密连锁的高度多态性基因座位组成。MHC基因 作为分子标记与微卫星标记相比显示了在选择平衡下的高度遗传多样性，其变异可反映基因组水平的变异，而多数受选择作用影响的分子标记则因为缺少变异性而无法阐述种群间的差异和适应性；微卫星位点因其主要受非选择性机制的影响而不适于阐述种群间的不同适应性(Queller et al .，1993；Kim et al .，1999)。因此，通过分析MHC的遗传变异可以提供物种的遗传多样性水平、进化历史和种群动态及种群遗传结构等信息。

本文以MHCⅡ类基因第二外显子为分子标记，对内蒙古8个布氏田鼠地理种群进行遗传多样性分析，以期得到布氏田鼠种群遗传多样性的分子证据，为进一步开展布氏田鼠的分子生物学研究提供分子数据。

样品来自于正镶白旗(115°16.331′E，42°25.611′N； n =62)、陈巴尔虎旗(119°44.735′E，49°32.652′N； n =52)、新巴尔虎左旗(118°03.776′E，49°18.152′N； n =56)、新巴尔虎右旗(118°22.573′E，48°21.625′N； n =50)、西乌珠穆沁旗(117°57.324′E，44°5.211′N； n =53)、二连浩特(112°23.564′E，43°53.245′N； n =65)、东乌珠穆沁旗(116°10.846′E，44°59.454′N； n =54)、锡林浩特(115°13.673′E，44°50.351′N； n =68)地区8个种群，共460只布氏田鼠，各取样点间的距离不小于200 km。样品采集信息见图 1。

图 1 布氏田鼠采集地点的分布 Fig. 1 Sampling sites of Lasiopodomys brandtii

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用DNA试剂盒提取基因组。以GenBank中登录号为AJ003232、AJ634270、AF084934、U88933、M73960、BC132163、K0012的序列作参考，设计1对引物：上游引物MF：5'-GGAATACGGTACATCTGAG-3'，下游引物MR：5'-CAACTCTCCGCCGCACAAGG-3'；PCR反应在PTC-200型DNA扩增仪上进行，PCR反应体系总体积为30 μL，其中1.0 mmol·L^-1 Tris-HCl(pH 8.3)，1.5 mmol·L^-1 MgCl₂，50 mmol·L^-1 KCl，150 μmol·L^-1 dNTPs，引物各0.25 μmol，1 U Taq DNA聚合酶，30 ng DNA。反应程序为：94 ℃变性45 s，54 ℃复性50 s，72 ℃延伸50 s，共30个循环。循环前95 ℃预变性5 min，循环后继续72 ℃延伸10 min。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测并送生工生物工程(上海)股份有限公司进行正反测序。

限制性内切酶RsaⅠ购自宝生物工程(大连)有限公司。酶切体系和条件按说明书进行。酶切产物用含溴化乙锭的8%琼脂糖凝胶电泳后拍照，观察结果。

用SPSS 20.0对酶切结果进行基因型统计。用Clustal X(Thompaon et al .，1997)进行序列比对。利用MEGA 6.0(Tamura et al .，2013)中的非加权平均算术法(UPGMA)对各种群进行聚类分析，利用Bootstrap Test检验所得聚类结果可靠性。用Arlequin(version 3.0)(Excoffier et al .，2007)对基因序列进行分析，统计多态位点数(number of polymorphic sites，S)，并以Pairwise difference分子距离计算单倍型多样性(haplotype diversity，H)、核苷酸平均差异数(mean number of nucleotide differences，π)和核苷酸多样性(nucleotide diversity，π_n)，种群结构的地理格局通过该软件的分子变异分析AMOVA模块来估测。

8个布氏田鼠地理种群MHCⅡ类基因第二外显子RsaⅠ酶切共检测到6个等位基因，13个酶切多态位点，定义了21种单倍型(表 1)，3个单倍型由8个种群共享；经卡方检验，6个酶切多态性位点上基因型频率不符合 Hardy-Weinberg平衡。正镶白旗种 群纯合子基因型频率较高(0.064 5~0.112 9)，杂合子基因型频率较低(0.016 2~ 0.048 4)，其他种群纯合子基因型频率与杂合子基因型频率基本一致。

8个地理种群共460只布氏田鼠的MHCⅡ类基因第二外显子序列长度均为261 bp。选取纯合单倍型aa作为对比序列，经DnaSP分析，整个核苷酸序列无碱基空缺，共发现57个变异位点，突变位点百分率为21.84%(图 2)。

图 2 布氏田鼠MHCⅡ类基因第二外显子序列分析 Fig. 2 Analysis of MHC class Ⅱ exon 2 of Lasiopodomys brandtii 方框内为Rsa Ⅰ识别序列，向上箭头表示酶切位点，向下箭头表示碱基突变位点。 Boxes represent recognized sequence of Rsa Ⅰ; upward arrows represent restriction enzyme sites for Rsa Ⅰ; downward arrows represent mutation site.

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用UPGMA法对8个布氏田鼠地理种群进行聚类分析显示，位于锡林郭勒高原东南浑善达克沙地南部的正镶白旗种群首先分化出来独立成一支，显示了这个区域与其他2个区域种群的隔离；位于锡林郭勒高原中部区域的二连浩特、锡林浩特、东乌珠穆沁旗和西乌珠穆沁旗种群形成一个单元分歧的进化分支；位于呼伦贝尔高原西南区域的新巴尔虎左旗、新巴尔虎右旗与陈巴尔虎旗种群形成一个单元分歧的进化分支。把这3个进化单元划分为A、B、C 3个区域(图 3)。

图 3 布氏田鼠种群的UPGMA聚类分析 Fig. 3 UPGMA clustering graph of eight Lasiopodomys brandtii populations 支点处的数字是置信度，即2 000次bootstrap抽样检验的重复百分比; ER. 二连浩特，XL. 锡林浩特，XW. 西乌珠穆沁旗，DW. 东乌珠穆沁旗，XZ. 新巴尔虎左旗，XY. 新巴尔虎右旗，CB. 陈巴尔虎旗，ZB. 正镶白旗； 下同。 The numbers at nodes are the percent occurrence in 2 000 bootstrap replicates; ER. Erlianhaote，XL. Xilinhaote，XW. Xiwuqi，DW. Dongwuqi，XZ. Xinbaerhuzuoqi，XY. Xinbaerhuyouqi，CB. Chenbaerhuqi，ZB. Zhengxiangbaiqi; the same below.

图选项

根据地理分布及谱系结果对布氏田鼠进行种群遗传多样性分析。遗传多样性信息统计结果显示，B区域种群多态位点数、单倍型多样性和核苷酸多样性最高，A区域种群次之，C区域种群最低(表 2)，且核苷酸差异分析表明，C区域种群与其他区域种群之间的遗传差异明显。AMOVA分析结果表明，区域类群间的遗传变异占总变异比率的64.08%，区域内种群间占7.78%，种群内占28.14%。除正镶白旗种群外，布氏田鼠种群具有较丰富的遗传多样性。遗传变异主要发生在区域类群之间和种群内。

尽管濒危物种的遗传多样性是生物多样性研究中的热点问题(黄磊，王义权，2004；常青等，2005；黎燕琼等，2011)，但生态学家及生物学家同样关注其他野生动物如啮齿类动物种群遗传多样性的研究。Bromham等(1996)和Li等(1996)对家鼠种群遗传多样性进行了研究，结果表明该物种的单倍型多样性和核苷酸多样性都较高。Hirota等(2004)研究结果揭示大林姬鼠 Apodemus speciosus 隔离种群的核苷酸多样性较高，而单倍型多样性较低。蔡振媛等(2007)基于线粒体D-loop序列分析探讨了高原鼢鼠 Myospalax baileyi 8个种群的遗传多样性，研究结果揭示该物种的单倍型多样性较高而核苷酸多样性较低。谢建云等(2007)对东方田鼠 Microtus fortis 4个种群线粒体D-loop区遗传多态性分析显示，该区遗传变异丰富，呈广泛的种类多态性。梁君(2007)对蒙新区子午沙鼠 Meriones meridianus 和长爪沙鼠 M. unguiculatus 的研究结果显示，2个物种的单倍型多样性和核苷酸多样性分别为0.991、0.047和0.976、0.007。Chen等(2010)基于线粒体控制区(D-loop)研究了分布于横断山脉白腹鼠 Niviventer excelsior 种群的遗传多样性，结果显示该物种有较高的单倍型多样性和核苷酸多样性，表明在更新世冰期，横断山脉复杂的地形结构为白腹鼠种群提供了避难所从而使其保持了高水平的遗传多样性。Fan等(2012)基于线粒体细胞色素b基因研究了分布于青藏高原东南部的中华姬鼠 Apodemus draco 种群的遗传多样性，结果表明该物种的单倍型多样性和核苷酸多样性较高，种群具有丰富的遗传多样性。黄翔和周立志(2012)基于8个多态性的微卫星位点，对子午沙鼠14个局域种群的160只个体进行了种群遗传多样性和遗传结构的分析，结果表明该物种具有高的遗传多样性。

遗传多样性是生物进化的内在源泉，其水平能反映出物种进化潜力和种群遗传适应潜力。遗传多样性常用单倍型多样性、核苷酸多样性来度量(Tajima，1983)。单倍型多样性、核苷酸多样性值越大，群体的遗传多样性越高。本研究结果显示，8个种群460只布氏田鼠MHCⅡ类基因第二外显子酶切基因型频率分析显示，除正镶白旗种群纯合子基因型频率较高，杂合子基因型频率较低外，其他种群纯合子基因型频率与杂合子基因型频率基本一致。卡方检验显示，13个酶切位点中6个位点偏离Hardy-Weinberg平衡，其中4个位点出现在正镶白旗种群，揭示正镶白旗种群纯合子所占的比例较高，杂合子所占的比例较低。序列分析表明，B区域种群序列多态性较高，A区域种群次之、C区域种群最低。8个种群460只布氏田鼠MHCⅡ类基因第二外显子酶切结果共检出21种单倍型，B区域的3个种群单倍型多样性最高，A区域的4个种群次之，C区域种群最低。本研究中B区域种群的单倍型多样性较A区域、C区域高，核苷酸多样性也比A区域、C区域高，符合上述规律。布氏田鼠与子午沙鼠和长爪沙鼠的单倍型多样性和核苷酸多样性类似，呈现出单倍型多样性高、核苷酸多样性低的特点。究其原因：首先，单个碱基的突变可以影响单倍型多样性，但对核苷酸多样性的影响却较小，与单倍型多样性相比，核苷酸多样性的提高需要更长时间的积累。因此，环境反复变化造成的种群缩小和快速增长被认为是造成这种遗传多样性特征的主要原因之一(缑敬轩，2004；曹华猛，2005)。布氏田鼠长期受特定的地理环境条件胁迫和栖息地片段化的双重作用，与其他北方啮齿类一样，种群大小受反馈调节的影响，数量在短时间内经历了涨落波动(Elton，1942；Zhong et al .，1985)，种群数量极端的波动即种群增长瓶颈效应能消除过去时间积累的核苷酸多样化变异，但又能快速导致少数碱基位点的快速进化而引起种群遗传结构的变化(Wright，1943)。其次，由于布氏田鼠营地下生活，环境相对稳定以及有限的迁徙扩散能力限制了基因流，任何短时间内的变异都能积累起来，从而使单倍型的多样性高，但提高核苷酸多样性却需要长时间的积累。

国内外许多学者研究过不同地理种群遗传多样性水平的差异并探讨了差异产生的原因。Paetkau等(1998)和周乐等(2007)研究表明，种群的遗传多样性水平与其种群的大小有显著的相关性。Wisely等(2002)对黑足鼬 Mustela nigripes 的研究表明，大种群的遗传多样性水平明显高于被隔离的小种群。这些研究结果揭示种群的遗传多样性水平与其种群的大小有显著的相关性，大种群的遗传多样性水平明显高于被隔离的小种群。本研究结果表明布氏田鼠种群总的遗传多样性水平较高，但就区域种群而言，A区域、B区域的种群均显示出较高的单倍型多样性和核苷酸多样性，C区域的正镶白旗种群较低。出现这种情况可能有以下原因：首先，布氏田鼠作为内蒙古草原的主要啮齿类动物，分布范围从内蒙古东部的典型草原、干草原到中部的荒漠草原，分布区中地理环境复杂多样，表明布氏田鼠对高寒环境有良好的适应能力，环境条件的差异对其遗传多样性水平影响较小。其次，A区域种群分布在呼伦贝尔高原，B区域种群分布在锡林郭勒高原，区域内没有大的山脉、河流的阻隔，地理屏障作用不明显，且区域内种群相对较大，种群之间的基因交流也相对较多。再次，C区域种群位于浑善达克沙地南部，因沙漠形成了它与其他地理种群之间基因交流的自然屏障而成为隔离封闭种群，且种群都相对较小，这可能是C区域种群遗传多样性较低的重要原因。