日本三角涡虫Dugesia japonica隶属于扁形动物门Platyhelminth涡虫纲Turbellaria三肠目Tricladida，具有极强的再生能力，因而成为研究动物再生机制的模式动物之一(Sluys et al., 2009)。Neoblasts是涡虫体内唯一具有增殖和分化能力的细胞，是其组织更新、损伤修复和再生的基础(Slack，2011；Rossi et al., 2014b；Scimone et al., 2014；Mangel et al., 2016)。然而关于neoblasts的组成一直以来争论不休，即涡虫体内的neoblasts是均质的还是像高等动物一样有一定程度的分化。Neoblasts最初是指蚯蚓体内未分化的胚胎样小细胞，1897年Randolph将其引入涡虫研究(Rink，2013)，特指涡虫体内具有较大核质比、对X-射线敏感的一群小细胞。在光学显微镜下，涡虫实质组织中各种细胞界限不清晰，细胞类型难以分辨。透射电镜(transmission electron microscope，TEM)下，neoblasts呈圆形，直径5~10 μm；细胞核较大，位于细胞中央，核内含少量异染色质；细胞质较少，内含大量游离核糖体和少量细胞器，富含拟染色体(chromatoid bodies)(Matsumoto et al., 2006；Rink，2013)。因为neoblasts形态差异不大，而且是多能或全能干细胞，因此最初认为neoblasts是均质的，然而近些年的研究表明neoblasts呈明显异质性，即neoblasts是由不同亚群组成的，其异质性主要表现在以下几个方面。

Baguna等(1990)通过研究涡虫的生长发育和退行性变化，推测neoblasts可能由3群细胞组成，即小细胞群(未定型、具有增殖能力)、较大细胞群(未分化、具有有限增殖能力)和第三群(完全无增殖能力，约占neoblasts总数的50%)。Schurmann等(1998)通过对离心纯化的neoblasts进行观察，根据形态学差异将其分为4类：Ⅰ型(圆形，核位于中央，数量较多)、Ⅱ型(梨状，具有显著的单极性)、Ⅲ型(双极状)和Ⅳ型(细胞核位于细胞一侧，胞浆内具泡状结构)。细胞培养显示，neoblasts细胞存活率达90%以上，且在1周内具有分裂能力。该研究表明neoblasts在形态上具有异质性，但这种形态学上的差异是否因离心造成并不清楚。Reddien等(2005)和Hayashi等(2006)分别以地中海涡虫Schmidtea mediterranea和日本三角涡虫为材料，用Hoechst 33342(标记核)、calcein AM(标记胞质)和PI(标记死细胞)3种荧光染料对分散的涡虫细胞标记后，进行荧光标记流式分选(fluorescence-activated cell sorting，FACS)，通过实验组与辐射致死组比较，将涡虫细胞分为3群，即X1、X2和XIS(或X-ray insensitive，Xin)。X1细胞呈圆形，胞质少，直径约10 μm，嗜Hoechst 33342，对X-射线敏感；X2细胞呈圆形，直径较X1小，约6 μm，嗜calcein AM；XIS(Xin)为X-射线不敏感细胞。上述研究证实了Baguna等(1990)关于neoblasts由小细胞群(X2)和较大细胞群(X1)组成的推测，但是否存在“第三群”还有待进一步研究。Higuchi等(2007)用TEM技术分别对从X1、X2和XIS选出的100个细胞进行观察后，将涡虫的细胞归为3类：干细胞(stem cells)、分化期细胞(differentiating cell或regenerative cells)和已分化细胞(differentiated cells)。干细胞具有典型的未分化细胞特征，胞浆内具有拟染色体；分化期细胞含轻度发育的多层粗面内质网(multiple rough endoplasmic reticulum，RER)和类似干细胞的胞质特征(如胞浆内含拟染色体)；已分化细胞有发达的RER和细胞特异细胞器。还有一些细胞，其特征介于干细胞和分化期细胞之间，被命名为未归类细胞(unclassified cells)。X1主要包括干细胞和分化期细胞，处于细胞周期的S/G₂/M期。分化期细胞可能是定向neoblasts或neoblasts的子代细胞。X2由neoblasts(19%)、分化期细胞(2%)、已分化细胞(56%)和未归类细胞(23%)组成。已分化细胞包括腺细胞、杆状细胞和肌肉细胞等。如果将未归类细胞作为neoblasts，则neoblasts占X2细胞总数的50%左右。值得注意的是，在X2内还有一群个体较小、含少量拟染色体和高度异染核的细胞群，处于G₀/G₁期，其功能还不明确。Higuchi等(2007)和Eisenhoffer等(2008)根据neoblasts核内常染色质和异染色质的含量，将其分为A型(常染色质含量高，胞浆富含拟染色体)和B型(异染色质含量高，胞浆含少量拟染色体)。X1群主要由A型neoblasts组成，占X1细胞总数的89%，A型neoblasts可能是已定型的子代干细胞；B型neoblasts占X2细胞总数的32%，可能是处于缓慢细胞周期中或定型过程中的neoblasts。由此可见，neoblasts是由具有一定形态差异的细胞群组成，这些形态差异的neoblasts可能是处于不同细胞周期的细胞，执行着不同功能，其细胞干性还需要进一步研究。

Salvetti等(2009)用不同非致死剂量X-射线辐射涡虫后，发现尽管涡虫体内的neoblasts数量因辐射明显下降，但涡虫体内仍有抗性细胞重新增殖，neoblasts数量得以恢复。研究还发现，在受辐射涡虫的腹面近神经系统部位有强烈的增殖活性，该处增殖形成的细胞向背部实质组织迁移并与背部抗性细胞汇合，最后重建完整的neoblasts细胞群。该研究表明，在neoblasts中可能存在对X-射线有抗性的细胞亚群。FACS分析显示：X-射线(5 Gy)辐射3 d后，X1和X2细胞数量均减少，后又逐渐上升，产生这种现象的原因可能是在X1中存在一个抗5 Gy辐射的亚群，它可以增殖形成X1和X2细胞；或在X2中亦存在一个辐射抗性亚群。射线抗性细胞可能是已经定型或处于分化期的细胞，它们可能具有重新获得细胞干性的能力。单细胞移植实验表明，cNeoblast(clonic neoblasts)主要形成于涡虫的腹面，而非致死剂量X-射线辐射后存活的neoblasts也主要位于腹面，因此cNeoblasts有可能是位于涡虫腹面的一个neoblasts亚群，也可能是由于技术原因导致不同位置neoblasts对辐射敏感性产生了差异，但从涡虫任何片段都能再生形成一个完整的个体看，cNeoblasts理应是广泛分布且数量较大的细胞群(Wagner et al., 2011)。辐射抗性是否由于细胞处于G₀期所致，neoblasts是否存在G₀期细胞仍需进一步研究。

采用细胞周期蛋白B基因(cyclinB基因)对X1和X2所处的细胞周期进行检测，结果表明X1内cyclinB阳性细胞达96%，而X2内为0，这表明X1细胞为处于分裂期的细胞。进一步研究显示，在X1中，约19.65%的细胞处于S期，74.70%处于G₂/M期；X2和XIS主要由处于非更新期细胞(处于G₀/G₁期)组成，分别占75.20%和81.63%(Reddien et al., 2005)。因此，neoblasts是由处于细胞周期不同阶段的细胞群组成，这些细胞群来源于同一祖先还是不同的祖先，它们的去向如何仍需深入研究。

Smedwi-1和DjpiwiA分别是地中海涡虫和日本三角涡虫neoblasts群的特异性标志基因，即二者所有neoblasts都呈Smedwi-1或DjpiwiA阳性，它们的编码蛋白属Argonaute蛋白家族的亚类。piwi基因最早发现于动物的生殖细胞中，编码PIWI蛋白，该蛋白能特异地与piRNA(PIWI-interacting RNA)相互作用，在表观遗传学水平和转录后水平沉默基因组自私性遗传元件(如转座子等)，参与生殖干细胞自我维持及分化、命运决定、减数分裂和精子形成等生物过程。与其他动物不同的是，涡虫中至少存在3种以上的piwi基因同源物，其分布也不仅限于生殖细胞系(Reddien et al., 2005；Guo et al., 2006；Rossi et al., 2006；Yoshida-Kashikawa et al., 2007；Wagner et al., 2011；Nakagawa et al., 2012)。在日本三角涡虫中，有4种piwi基因同源物——DjpiwiA/B/C/D。DjpiwiB基因仅在排列于身体背中线上的小细胞中表达，DjpiwiB阳性细胞不直接参与再生过程，其所在部位对身体重塑非常重要，因此它们可能在涡虫身体重塑中起重要作用(Rossi et al., 2006；Salvetti et al., 2009)。用原位杂交(in situ hybridizations)和实时定量荧光PCR(qPCR)技术检测Smedwi-1/2基因在X1和X2中的表达情况发现，二者主要表达于X1细胞群，在X2中的表达量低，因此X1和X2在分子特征上是不同质的(Reddien et al., 2005；Eisenhoffer et al., 2008)。Hayashi等(2010)用单细胞qPCR对X1、X2和XIS的分子特征进行研究，结果表明：S期特异基因(Djmcm2、Djmcm3和Djpcna)、piwi基因同源物(DjpiwiA/B/C/D)、拟染色体组分(DjvlgA和Djcbc-1)和生殖干细胞特异性基因nos在X1、X2和XIS中的表达均存在差异，如在X1中，有18.5%细胞呈Djmcm2阳性，44.4%呈Djmcm3阳性，45.5%呈Djpcna阳性；51%的Djmcm2阳性细胞共表达Djpcna基因，约50%的Djmcm3阳性细胞共表达Djpcna基因，Djmcm2阳性细胞中有36.4%共表达Djmcm3基因；仅有3.9%的细胞共表达所有3种基因。Moritz等(2012)用提取的neoblasts细胞膜蛋白免疫小鼠制备单克隆抗体，对neoblasts的表面标志进行研究，结果表明：在X1中至少存在6-9.2(8-22.2)⁺/NB.32.1g⁺/Agat1⁺/Myhc⁺(约占X1的2/3)和6-9.2(8-22.2)^-/NB.32.1g^-/Agat1^-/Myhc^-(约占X1的1/3)2个细胞亚群，这2个亚群可能是命运未决定且有自我更新能力的细胞。van Wolfswinkel等(2014)通过单细胞转录组分析将neoblasts分为2个主要亚群，即ζ亚群和δ亚群。ζ亚群主要产生有丝分裂期后的细胞系，如上皮细胞等(Zhu et al., 2015)；δ亚群对损伤产生应答，具有多能细胞特征，能产生如肾管细胞、肌肉细胞、神经元细胞、视觉细胞、肠上皮细胞及ζ亚群。Rossi等(2014a)对neoblasts中反式剪切前导序列SL 3(spliced leader 3)研究发现：在X1中，Smedwi-1 ⁺/SL 1⁺细胞明显多于Smedwi-1⁺/SL 3^-细胞，表明SL 3阳性细胞是neoblasts的一个亚群。Scimone等(2014)对损伤涡虫neoblasts转录组进行研究，结果表明，再生过程中，涡虫体内存在形成再生组织所需的含组织特异性转录因子的neoblasts，再生芽基由高度异质的neoblasts谱系形成。值得注意的是，在涡虫脑神经元中也发现DjpiwiB、DjpiwiC、DjvlgA和Djcbc-1等基因表达，而上述基因均为neoblasts标志基因。在X1中也存在少量DjMHC-A(肌细胞标志基因)阳性细胞，同时这些细胞均为DjpiwiA阳性，具有neoblasts分子特征。在X2中有81.8%的DjMHC-A阳性细胞也表达neoblasts标志基因；sp6-9 ⁺/eya⁺(特异表达于视杯)与smedwi-1 、h2b(histone h2b)共表达于视杯前体细胞(Hayashi et al., 2010；Scimone et al., 2010)。上述研究表明neoblasts中可能包含已分化定向的干细胞。Zhu等(2015)通过转录组分析筛选出32个祖代上皮细胞标志，这些标志将祖代上皮细胞分为早、晚2个亚群——prog-1/2 亚群(早期)和AGAT-1亚群(晚期)。早期亚群在辐射后48 h内消失，而晚期亚群在48 h至7 d消失。细胞质中具拟染色体是neoblasts最显著的特征(Coward，1974；Hori，1982)之一。日本学者Kashima等(2016)研究发现，在日本三角涡虫中，DjCBC-1特异性拟染色体与Y12特异性拟染色体在结构上具有显著的不同。后者与DjpiwiC相似，具有抗转座活性，neoblasts在拟染色体组成上的异质性还有待进一步研究。总之，neoblasts是由具有不同分子特征的亚群组成，不同亚群在neoblasts中比例不同，而且具有不同的分化能力和分化方向，并可能存在干性差异。

Noeblasts是成体日本三角涡虫细胞循环、损伤组织修复及器官再生的细胞基础，是涡虫生物学研究的热点之一。尽管单细胞移植实验证明了neoblasts的多能性(Wagner et al., 2011)，但关于neoblasts的组成之争并没有彻底解决。近年随着生物技术的发展，生物学家利用组织学、免疫学及分子生物学相关技术对neoblasts的组成进行了研究，认为neoblasts是异质的，由不同细胞亚群组成，但目前并不知道neoblasts究竟包含哪些亚群，这些亚群具有怎样的标志及功能，更不清楚这些亚群之间的关系。因此，进一步系统地研究和鉴别这些亚群，通过基因敲除等技术对其功能进行研究，将有助于解析涡虫再生和损伤修复机制，并将为其他动物乃至人类的干细胞生物学研究提供借鉴。