丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases, MAPKs)是在动物细胞内广泛存在的一类丝/苏氨酸蛋白激酶，重要的家族成员有：细胞外信号调节蛋白激酶(ERK1/2)、c-JNK末端激酶/应激活化蛋白激酶(JNK/SAPK)、P38丝裂原活化蛋白激酶(P38 MAPK)和ERK5/大丝裂素活化蛋白激酶(BMK1)。ERK1/2和P38在MAPK中是2条相对独立的信号转导通路，前者可被细胞因子、生长因子、神经递质和激素等激活，通过磷酸化胞浆蛋白、核转录因子、细胞骨架蛋白及酶类等促进细胞的增殖、生长和分化(Galabova-Kovacs et al., 2006；Roskoski，2012)；而P38 MAPK能被一些环境应激、炎症信号和生长因子激活，促进细胞凋亡、炎症反应、生长抑制等(Lysiak et al., 2000；Gangwani et al., 2015)。大量文献报道，MAPK信号通路对哺乳动物生精细胞及精子的发生与凋亡、精子在附睾中的成熟、卵细胞受精前的精子获能和顶体反应等有重要的调节作用(Liu et al., 2014；Zhu et al., 2015)，被认为是精子发生的重要决定因素之一(Alomg & Naor，2010)。

牦牛Bos grunniens与普通牛杂交的后代——犏牛具有明显的杂种优势，但杂种F₁~F₃代犏牛雄性不育，这严重阻碍了犏牛杂种优势的横向保留和纵向遗传。因此，探明犏牛雄性不育的机理是牦牛杂交育种与改良需要解决的重要科学问题。本实验室前期对牦牛和犏牛睾丸组织差异表达miRNA的KEGG分析表明，富集最多的是MAPK通路(Li et al., 待发表)，提示该信号通路可能与犏牛雄性不育有关。有研究发现，ERK1、ERK2、P38 MAPK在不同阶段的生精细胞中均有表达(Ranawat & Bansal，2009)。ERK1/2参与睾丸组织中细胞的增殖及精子发生过程中有丝分裂以及减数分裂的调控(Sette et al., 1999)，而P38 MAPK参与生精细胞的凋亡过程(Zhu et al., 2015)。F₁代犏牛睾丸中的支持细胞、生殖细胞、间质细胞数量较少，且精原细胞凋亡数量较多(张旭静，2001)。因此，本研究的假设是：雄性不育犏牛与牦牛睾丸中MAPK通路中的相关基因可能存在表达差异。本研究采用实时荧光定量PCR技术检测牦牛和犏牛睾丸中ERK1、ERK2、P38基因mRNA的表达水平，以期从信号通路变化上探索犏牛雄性不育的分子机制。

于秋季在成都市青白江一屠宰场采集麦洼牦牛和犏牛(母麦洼牦牛与公黄牛的杂交后代)的睾丸样品。实验动物包括健康的成年雄性牦牛10头和雄性犏牛7头，在商业化屠宰时迅速采集新鲜睾丸，经过适当分割后置于干冰中冷冻，立即带回实验室并保存于-80 ℃冰箱中。

主要试剂包括：Trizol Reagent(美国Ambion公司)，QuantiFast SYBR Green PCR Kit(德国QIAGEN公司)，RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(美国Thermo Scientific公司)，Cycle-pure Kit(美国OMEGA公司)，Long Taq DNA Polymerase(美国GeneCopoeia公司)。

主要仪器包括：Biowave DNA紫外可见分光光度计(英国Biochrom公司)，CFX96 Touch^TM荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad公司)，CR21G高速冷冻离心机(日本日立公司)。

采用Trizol试剂按试剂盒说明提取牦牛和犏牛睾丸组织的总RNA，紫外分光光度法测定浓度。根据反转录试剂盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit说明书的步骤，以4 μg总RNA为模板进行反转录，得到cDNA。

参照普通牛ERK1、ERK2、P38基因的预测序列(GenBank登录号：NM_001110018、NM_175793、NM_001102174)，以及普通牛GAPDH、18s RNA基因的预测序列(GenBank登录号：NM_001034034、NR_036642)，用Primer Premier 5.0分别设计目的基因和内参基因的定量PCR引物(表 1)，并由上海生工生物工程有限公司合成。

将反转录得到的牦牛睾丸组织cDNA进行PCR扩增，本实验采用25 μL的PCR反应体系：超纯水9.5 μL，模板cDNA 1 μL，Long Taq DNA Polymerase 12.5 μL，上、下游引物各1 μL。PCR反应条件：预变性(95 ℃ 4 min)；变性(95 ℃ 30 s)，退火(ERK1：66 ℃ 15 s；ERK2：66 ℃ 30 s；P38：68 ℃ 20 s)，延伸(72 ℃ 30 s)，35个循环；再72 ℃ 5 min，最后4 ℃保存。扩增产物1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

分别对上述基因进行PCR扩增，根据PCR纯化试剂盒说明书步骤将产物纯化后进行10倍梯度稀释，将稀释梯度浓度为每毫升10⁴~10⁹拷贝数的产物作为模板，进行荧光定量PCR扩增，绘制标准曲线。

以反转录的牦牛和犏牛睾丸组织cDNA为模板，采用实时荧光定量PCR方法检测ERK1、ERK2、P38基因在牦牛和犏牛睾丸中的相对表达量。实时荧光定量PCR反应体系同前。PCR反应条件：预变性(95 ℃ 5 min)；变性(95 ℃ 15 s)，退火(ERK1：66 ℃ 15 s；ERK2：66 ℃ 20 s；P38：68 ℃ 20 s)；延伸(72 ℃ 15 s)，40个循环；65 ℃~95 ℃制作熔解曲线。每个样品做2个重复。

将牦牛睾丸目的基因的表达量作为对照，用双内参基因GAPDH和18s RNA的几何平均数进行校准。2^-△△Ct法计算ERK1、ERK2、P38基因在牦牛和犏牛睾丸组织中的相对表达水平(Livak & Schmittgen，2001)。实验数据用平均值±标准误表示，定量结果用SPSS 19.0进行单因素方差分析。

根据普通牛ERK1、ERK2、P38基因预测序列设计的定量PCR引物，均从牦牛睾丸cDNA中扩增出特异性高的产物，条带亮、无杂带，且与预期片段长度相符(图 1)。

图 1 牦牛睾丸ERK1、ERK2、P38基因的PCR扩增结果 Fig. 1 Amplification of ERK1, ERK2 and P38 genes of yak testis M. DL2000 Marker，A： 1~4. ERK1基因, B： 1~3. P 38基因，4. ERK 2 基因。 M. DL2000 Marker, A: 1~4. ERK1 gene, B: 1~3. P 38 gene, 4. ERK 2 gene.

图选项

以GAPDH和18s RNA为内参基因，对牦牛和犏牛睾丸中ERK1、ERK2、P38基因mRNA水平进行了实时荧光定量PCR检测，ERK1、ERK2、P38基因扩增效率依次为98.6%、93.8%和98.2%，扩增效率均在CFX96 Touch^TM荧光定量PCR仪要求的有效范围内(92%~105%)。3个目的基因的标准曲线线性关系好(R² > 0.99)，且熔解曲线峰单一，表明它们均被特异性扩增(图 2)。

图 2 ERK1、ERK2、P38基因的荧光定量PCR标准曲线和熔解曲线 Fig. 2 The standard curve and melting curve for fluorescence quantitative PCR of ERK1, ERK2 and P38 genes A、B、C依次为ERK1、ERK2和P38基因荧光定量PCR的标准曲线(a)和熔解曲线(b); (a) y轴表示Cq值，x轴表示起始模板量，(b) y轴表示随时间推移的相对荧光单位，x轴表示温度。 A, B, C are the standard curve (a) and melting curve (b) for fluorescence quantitative PCR of ERK1, ERK2 and P38 genes, respectively; (a) y-axis: value of Cq, x-axis: log starting quantity, (b) y-axis: the rate of change of the relative fluorescence, x-axis: temperature.

图选项

实时荧光定量PCR结果显示，ERK1、ERK2基因在牦牛睾丸中的表达量极显著高于犏牛(P < 0.01)，其中牦牛的ERK1基因表达是犏牛的6倍，牦牛的ERK 2基因表达是犏牛的2.4倍，而P 38基因表达差异无统计学意义(图 3)。

图 3 ERK1、ERK2、P38 基因在牦牛和犏牛睾丸中的相对表达量 Fig. 3 Relative expression of ERK1, ERK2 and P38 genes in the testes of yaks and cattle-yaks ** P < 0.01.

图选项

本研究从牦牛睾丸总RNA中分别特异性扩增出ERK1、ERK2、P38基因。实时荧光定量PCR结果显示，ERK1、ERK2基因在牦牛睾丸中的表达量极显著高于犏牛，提示这2个基因可能与牦牛睾丸精子的发生有密切联系。根据相关文献报道，犏牛睾丸组织中与精子发生相关的以及与哺乳动物精母细胞减数分裂相关的SYCP3基因、Dmart7基因、DDX4基因mRNA水平均极显著低于牦牛(屈旭光等，2008；金帅等，2013；周阳等，2013)。本实验室前期研究也发现，参与精母细胞减数分裂的基因如Msch 4基因，在犏牛睾丸组织中mRNA水平极显著低于牦牛(曾琴等，2013)。但牦牛睾丸组织这些基因高表达于犏牛睾丸组织的原因尚不清楚。ERK1在小鼠精母细胞减数分裂中G₂/M过渡期被特异激活，有助于促成熟因子机制的激活，是减数分裂中期染色体凝集必不可少的(Sette et al., 1999)。在精母细胞减数分裂中的染色体凝集，需要通过ERK1/2信号通路激活细胞周期调控蛋白激酶家族，促进细胞正常分裂的进行(Di Agostino et al., 2002)。这表明ERK1、ERK2基因参与生殖细胞减数分裂的调控，对精子的发生具有十分关键的作用。因此，推测犏牛睾丸中ERK1、ERK2基因下调可能影响其正常的精子发生。

Ge等(2014)报道，激活ERK1/2通路能促进小鼠睾丸支持细胞株的生长。Nan等(2014)研究发现，抑制ERK1/2的活化可显著抑制大鼠睾丸支持细胞的增殖。由此可见ERK信号通路的激活是睾丸支持细胞及生殖细胞增殖所必需的。另外，ERK1/2信号通路参与促性腺激素释放激素诱导的促卵泡素和促黄体素生成，二者是调节精子发生的重要激素(Gur et al.，2001)。促卵泡素可激活ERK1/2级联反应，诱导小鼠睾丸支持细胞的胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)的表达，进而促进生精细胞增殖，抑制精原干细胞分化(Hasegawa et al., 2013)。睾丸间质细胞MEK/ERK信号通路缺失导致睾丸间质细胞发育不全和高促性腺激素性性腺功能减退症(Yamashita et al., 2011)。犏牛睾丸中ERK基因mRNA水平极显著低于牦牛，可能会直接或通过影响与生殖有关的激素的合成，导致犏牛睾丸组织细胞异常，影响精子的发生。

有研究发现，大鼠睾丸内温度的升高和睾丸激素水平的降低都可激活P38 MAPK，加速精子凋亡(Jia et al., 2009)。输精管结扎后的大鼠初级精母细胞发生凋亡，且其凋亡与P38的激活存在时间和空间上的关系，表明P38与生精细胞的凋亡密切相关(Zhu et al., 2015)。本研究中P38基因mRNA在牦牛和犏牛睾丸中均有表达，但表达量差异不显著，这可能与P38 MAPK主要参与炎性刺激所引发的细胞凋亡及热诱导精子损伤有关(Rahman et al., 2014)。有报道表明，犏牛睾丸中细胞凋亡显著高于牦牛(张旭静，2001；Lou et al., 2014)，但本研究结果提示，犏牛睾丸中生精细胞的凋亡可能并不依赖于P38 MAPK信号通路。