研究精子结构不仅能为研究生物的分类地位、进化规律提供理论依据，同时也是探究生物受精机制的基础。有尾两栖类动物精子结构的研究(Selmi et al.，1997；郑中华等，2004，2005；Emilio et al.，2009)多集中在蝾螈科Salamandridae和小鲵科Hynobiidae，而对隐鳃鲵科Cryptobranchidae物种精子形态结构的研究相对较少。

大鲵Andrias davidianus俗称娃娃鱼，隶属于两栖纲Amphidia有尾目Urodela隐鳃鲵科，为国家Ⅱ级重点保护动物。近年来，由于环境变化和人为干扰，加上大鲵对生境依赖性强、迁徙能力差等因素，野生大鲵种群数量明显下降(乔志刚等，2013)。为增加大鲵的种群数量，提高大鲵的繁育能力，对其开展繁殖生物学研究十分必要。动物精子的形态结构与受精过程密切相关，是繁殖生物学重要的研究内容之一。许多学者(邓凤娇等，1998；刘鉴毅等，1999；周海燕等，2003；罗庆华等，2005；郑中华等，2008；彭亮跃，2010；殷梦光等，2014)曾对大鲵的繁殖生物学及其精子和卵子的形态结构开展了部分研究，为了解大鲵的繁殖特点提供了相关资料。关于大鲵精子的形态结构，周海燕等(2003)、郑中华等(2008)、彭亮跃(2010)等有过相关报道，但对大鲵精子线粒体的阐述较少，且关于大鲵精子顶体的记述有所不同。本研究应用扫描电镜和透射电镜技术对大鲵成熟精子的形态结构进行了观察，旨在深入认识大鲵精子的形态特征，为大鲵的繁殖生物学积累基础资料。

1 材料和方法 1.1 材料

实验材料由河南省济源市宏基鲟鲵养殖基地提供。挑选6~9龄，体质量3.80~7.50 kg，成熟、健康的泄殖孔周围呈橘瓣状隆起，泄殖孔内缘周边有一圈米粒状白点分布的雄性大鲵10尾待用。

1.2 方法 1.2.1 采精方法

采用绒毛膜促性腺激素(HCG)与促黄体素释放激素类似物(LRH-A)的混合溶液进行人工催产，催产剂量为：每千克体质量的雄性大鲵注射HCG 2 000 IU+LRH-A 20 μg。将注射后的大鲵放入具流水条件的水池中等待其精子成熟。水温(19±1)℃时，50 h(效应时间)后检查成熟情况并采集精子。

采精方法：将大鲵腹部朝上，轻压腹部，挤出膀胱中的尿液后，采集精子(要求无粪便、无血液等污染)。放入盛有2.5%戊二醛溶液的玻璃瓶中，密封，标记，置4 ℃冰箱保存，用于电镜制样和实验观察。

1.2.2 扫描电镜制样

在干净的培养皿中平铺一层滤纸，其上放置若干18 mm×18 mm的盖玻片(平铺、不重叠)，将煮沸的5%琼脂液缓缓倒入(没过盖玻片即可)，放入37 ℃烘箱烘干；剪下盖玻片放入新的培养皿中，用吸管吸取上述保存的精子溶液滴加到盖玻片上，5 min后依次用30%、50%、70%、80%、90%、100%(2次)梯度乙醇洗涤各10 min；最后在盖玻片上滴加一层叔丁醇，-20 ℃至结晶，真空泵干燥30 min 取出。干燥后的样品喷金50 s，以日立SU8010扫描电镜观察、摄像。

1.2.3 透射电镜制样

取2.5%戊二醛溶液固定保存的精子溶液用磷酸盐缓冲液(0.1 M，pH7.2~7.4)漂洗后，滴加1%锇酸进行再固定；依次用梯度乙醇(30%、50%、70%、80%、90%、100%、100%)、乙醇∶ 丙酮(3∶ 1/1∶ 1/1∶ 3)、丙酮(2次)脱水，每次10 min；环氧树脂(Epon812)包埋，莱卡(Leica U7)超薄切片机切片，5%醋酸铀-柠檬酸铅双染法染色，日立HT-7700透射电镜观察、摄像。

2 结果

在扫描电镜下，大鲵的成熟精子由头部、颈部和尾部3部分组成(图版Ⅰ：1)。精子总长216.36 μm±9.93 μm(n=30)，头部长65.80 μm±3.70 μm(n=30)；颈部较短，多不明显；尾部细长，长为153.52 μm±3.22 μm(n=30)，约占总长的2/3。

2.1 精子头部结构

扫描电镜观察发现，大鲵成熟精子头部较直，前端渐细呈丝状或锥状，无顶体钩(acrosomal bar，图版 Ⅰ：2，4)，中后端呈棒状，表面有密集的点状颗粒(图版Ⅰ：7)。成熟过程中的精子头部中末端外周有类似细胞质的物质包围成的厚壁，称胞质团(cytoplasmic droplet，图版Ⅰ：6)，此外，少数精子头部顶端有多根纤维互相缠绕成纤维束(fiber bundle，图版Ⅰ：5)。透射电镜观察发现，大鲵精子头部由顶体(acrosome)、穿孔器(perforatorium)和细胞核(nucleus)组成，细胞核后端凹陷的部分成为核窝(nuclear fossa)，核窝与颈部相连(图版Ⅱ：1)。

顶体位于细胞核前端，纵切面为锥形，电子密度较高，分布均匀，外面有膜包裹，近核端在核的两侧，向顶端渐细；顶体下有一电子透明区，称为顶体下腔(subacrosomal space)；在顶体下腔的中央，细胞核的前端，有一锥形结构，为穿孔器(图版Ⅱ：5)。

细胞核呈棒状，前段渐细，与穿孔器相连(图版Ⅱ：1)。核内染色质(chromatin)分布均匀，高度浓缩为致密状态；细胞核的近前段，有一电子透明通道，为核内通道(endonuclear canal，图版Ⅱ：2，3，4)；核内其他部位分布有少量不规则的电子透明区，为核空隙(lacunae，图版Ⅱ：2，7)；细胞核内仅在靠近核窝处有少量线粒体(mitochondria，图版Ⅲ：3)，而在细胞核外分泌的胞质团中发现有大量线粒体存在(图版Ⅱ：7)。在大鲵精子头部横切中，仅见高度浓缩、分布均匀的染色质，未发现细胞核内、外有分层现象(图版Ⅱ：6)。

2.2 大鲵精子颈部结构

大鲵精子颈部较短(图版Ⅰ：1)，扫描电镜下不明显，无波动膜(undulating membrane)。透射电镜下，可见头部和尾部相连处存在一特殊区域，为大鲵精子的颈部。颈部由核窝(nuclear fossa)、近端中 心粒及远端中心粒(proximal and distal centriole)、轴丝(axoneme)、 线粒体(mitochondria)和轴纤维(axial fiber)组成(图版Ⅲ： 1，2)。其中近端中心粒位于核窝前端，与精子长轴垂直；远端中心粒位于近端中心粒后，与精子长轴平行，形成轴丝基部。核窝内、外分散有少量的线粒体。

2.3 大鲵精子尾部结构

大鲵精子尾部由轴纤维(axial fiber)、波动膜、轴丝(axoneme)和轴丝旁纤维(juxta-axonemal fiber)组成(图版Ⅲ：5)。扫描电镜下可见，轴纤维呈圆柱形，与颈部相连；波动膜包围轴纤维并与轴丝相连；轴丝较长，从头部末端一直贯穿至尾部，呈“Ω”形依附在轴纤维上，部分精子在尾部末端可以看到单独的轴丝结构(图版Ⅲ：4)。透射电镜下观察发现，轴纤维与精子长轴平行，紧接于颈部近端中心粒下面，并一直延伸到尾部；轴纤维横切面近似“心”形，主要由2种不同成分构成，外层电子密度较低，称为皮质(cortex)，内层电子密度较高，称为髓质(medulla)，皮质层外面有膜包裹(图版Ⅲ：5)；波动膜为膜样结构，横切片可见波动膜包裹着整个轴纤维，膜的一侧伸展与轴丝相连，连接段中充满细胞质；轴丝由2根中央微管和9对外周微管组成，属典型的“9+2”结构；轴丝的一侧平行排列着致密纤维，称为轴丝旁纤维，横切显示，轴丝旁纤维呈半圆形，外面有膜包裹(图版Ⅲ：6)。

3 讨论 3.1 大鲵精子头部顶体结构探讨

顶体是精子结构中最重要的部分之一，是受精的结构基础。头部有顶体、顶体下锥、穿孔器是有尾两栖动物精子的共同特征。已有研究表明，两栖类小鲵科、蝾螈科的龙洞山溪鲵Batrachuperus longdongensis(郑中华等，2005)、镇海棘螈Echinotriton chinhaiensis(郑中华等，2004)、意大利蝾螈Lissotrition italicus(Emilio et al.，2009)、眼镜蝾螈Salamandrina terdigitata(Selmi et al.，1997)、高山蝾螈Triturars alpestris apuanzcs( Selmi et al.，1997)等的精子头部前端均有顶体结构存在，穿孔器起始于顶体前段或顶体钩，延伸到细胞核前部末端。

不同研究者关于大鲵精子头部有无顶体及其顶体结构的看法不一。周海燕等(2003)认为，大鲵精子头部无顶体，精子头部前段的丝状结构为染色质，仅有1层细胞质膜包围，膜内没有囊泡和高尔基复合体，不是顶体结构。而郑中华等(2008)、彭亮跃(2010)的研究表明，大鲵精子头部具有顶体，但两者对顶体结构认识不同。郑中华等(2008)采用扫描电镜观察发现，大鲵精子头部顶端为顶体，顶体由顶体鞘(acrosomal sheath)和穿孔器组成；有一部分精子头部的顶体鞘脱落，仅见细长如针状的穿孔器存在。彭亮跃(2010)在透射电镜下发现，大鲵精子头部存在顶体复合物，由顶体、顶体下锥和穿孔器组成；扫描电镜下大鲵精子头部顶端只见一细丝状结构，为穿孔器。

本研究认为大鲵精子同其他有尾两栖类相似，存在顶体和穿孔器。扫描电镜观察发现，大鲵精子头部前端渐细，呈锥状或丝状。透射电镜观察发现，大鲵精子头部由顶体、穿孔器和细胞核组成，顶体位于细胞核前端，纵切面为锥形，电子密度较高，分布均匀，外面有膜包裹，近核端在核的两侧，向顶端渐细；穿孔器为一锥形结构，位于顶体下腔的中央，细胞核的前端，与彭亮跃(2010)报道中的图片基本相似。综合认为，扫描电镜下观察到的锥形头部尖端 即为精子顶体，丝状结构为精子头部顶端顶体鞘脱落后裸露的穿孔器，精子头部顶体鞘脱落现象普遍(郑中华等，2008)；本研究精子头部横切在透射电镜下未观察到顶体和穿孔器，或与切片制作过程有关。大鲵精子的头部结构与大鲵成熟卵子表面平整、不存在受精孔(邓凤娇等，1998；彭亮跃，2010)的生理结构是适应的，而大鲵精子头部顶体鞘脱落现象对精子活力及受精能力的影响有待进一步研究。与其他有尾两栖动物不同，大鲵精子头部无顶体下锥，这可能是由于顶体下锥和穿孔器功能相似(Garda et al.，2002)导致的结构简化。

3.2 大鲵精子活力状况与其线粒体数量

线粒体通常是精子维持运动的主要能量来源。本研究观察发现，大鲵精子仅在头部细胞核靠近核窝处和颈部有少量线粒体存在，尾部不见线粒体的分布，这与线粒体大量存在于精子尾部的有尾两栖动物，如蝾螈科(郑中华等，2004)、钝口螈科(Sever & Klopfer，1993)和无肺螈科(Wortham et al.，1977)等科的物种有明显差别。乔志刚等(2013)研究报道，人工催产雄性大鲵，观察到大鲵成熟精子运动缓慢、精子活力维持时间短，结合人工催产大鲵受精率较低的这一生产实际，分析可能与大鲵精子线粒体数量少，精子运动缺乏能量供给有关。

另外，研究发现，精子成熟过程中头部会分泌大量细胞质，在精子头部外周形成厚厚的突起，其中含有大量线粒体，推测这可能是在精子变态过程中，线粒体随胞质排出体外的一种正常现象，但线粒体外排的机理和作用仍有待深入研究。

3.3 大鲵与其他有尾目动物精子尾部结构比较

两栖类有尾目动物精子结构的研究表明，精子尾部多有中段、主段、末段之分，且各段组成结构、轴纤维的形状多有不同。一般情况下，中段由轴纤维、轴丝、波动膜、轴丝旁纤维和线粒体组成，主段线粒体消失，末段通常只有轴丝和轴丝旁纤维。

与其他有尾目动物的精子结构相比较，大鲵精子尾部符合有尾目动物精子结构的一般特征，其尾部也由轴纤维、轴丝、波动膜和轴丝旁纤维组成。但大鲵精子的尾部结构相对简单，其尾部没有明显的分段，横切面似“心”形状。同小鲵科物种相似，大鲵精子尾部没有线粒体(表 1)。

研究认为大鲵精子尾部的轴丝结构在精子运动中起着重要作用，而精子尾部的波动膜或类似于鱼类精子结构中的侧鳍(刘雪珠，杨万喜，2002)，不仅起到连接轴丝与轴纤维的作用，可能对大鲵精子波浪式的运动具有一定的推动作用。