外阴鳞癌是妇科常见的恶性肿瘤之一，治疗主要以手术为主，晚期和复发病例辅以放疗和化疗。早期5年生存率可达86.3%，而伴有淋巴结转移或远处转移的晚期患者生存率仅为53.3%和18.6%[1]。其原因是化疗对外阴鳞癌并不是很敏感，放疗的剂量限制导致患者不能继续接受治疗，复发的患者临床上治疗比较棘手。目前的免疫治疗和靶向治疗有局限性，在外阴鳞癌的治疗中开展很少。因此，寻求有效的治疗方法极为重要，中药在防治肿瘤中具有独特的优势，能够有效地改善患者症状，提高生存质量，延长生存期，给肿瘤治疗带来希望。中药的作用机制也是临床上的研究热点。
蛇床子素(osthole或osthol)又名甲氧基欧芹酚或欧芹酚甲醚，其化学名称为7-甲氧基-8-异戊烯基香豆素，是从伞形科植物蛇床子(Cnidium monnieri)中提取分离的香豆素类化合物。研究表明，蛇床子素具有抗炎、抗骨质疏松、抗肝炎、抗变态反应等多种药理活性[2-3]。目前研究已证实，蛇床子素治疗肝癌、肺癌、卵巢癌等均有一定作用[4-6]，而其对外阴鳞癌的作用及机制研究甚少。本实验拟利用体外培养的人外阴鳞癌SW962细胞株，观察蛇床子素对其增殖和凋亡的影响，探讨可能的作用机制。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞株人外阴癌细胞系SW962细胞，购于上海中科院细胞库。
1.1.2 药物与试剂蛇床子素(西安凯来生物有限公司，检测纯度≥98%)，使用DMSO溶解，配制成200 mmol·L-1的贮存液，过滤除菌后4 ℃避光保存，使用时以高糖DMEM稀释用于细胞培养。重组人胰岛素生长因子1(recombinant human insulin like growth factor 1，rh-IGF-1，北京博尔西科技有限公司)；胎牛血清、青霉素链霉素双抗、高糖DMEM培养基(Hyclone公司)；MTT、细胞凋亡试剂盒、DAPI染液(江苏凯基生物技术股份有限公司)；Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3、p-Akt及PI3K抗体(Abcam公司)；GAPDH抗体、β-actin抗体、羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG(沈阳万类科技有限公司)；RIPA裂解液、PMSF(碧云天生物技术有限公司)；ECL显色剂(Millipore公司)。
1.1.3 仪器ELx808酶标仪(BioTek公司)；倒置荧光显微镜带CCD成像(Nikon公司)；台式高速冷冻离心机(Thermo公司)；微型离心机(Corning公司)；CytoFLEX流式细胞仪(Beckman Coulter公司)；电泳仪(Bio-Rad公司)；MicroChemi化学发光型凝胶成像系统(Azure公司)。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养将SW962细胞接种于含100 kU·L-1青霉素、100 mg·L-1链霉素、10%胎牛血清的高糖DMEM培养基。于37 ℃、5% CO2、饱和湿度下培养。取对数生长期细胞用于实验。
1.2.2 细胞增殖分析将对数生长期的SW962细胞制成1×108·L-1浓度细胞悬液，接种于96孔板内，分组加入含蛇床子素(10、25、50、75、100、125、150、200 μmol·L-1)的培养基及含有与200 μmol·L-1蛇床子素溶液等体积的含DMSO的培养基各200 μL，每组设6个复孔，以不加蛇床子素组为空白对照组。96孔板置于37 ℃、5% CO2培养箱培养24、48 h后，每孔加入5 g·L-1的MTT溶液20 μL，培养4 h后吸去培养液，每孔加DMSO 150 μL避光溶解结晶，用酶标仪于波长570 nm处读取吸光度值(A)，按照如下公式计算增殖抑制率：增殖抑制率=(1－实验组A570值/空白组A570值)×100%。
1.2.3 DAPI染色实验将SW962细胞以1×108·L-1浓度，每孔2 mL接种于96孔板，待贴壁后，分别加入浓度为0、25、50、75 μmol·L-1的蛇床子素培养基，培养24 h后，PBS洗涤3次，加入DMEM配制的浓度为5 g·L-1的DAPI染液，每孔1 mL，37 ℃培养10 min，PBS冲洗3次后，选用360 nm的激发波长观察细胞形态。
1.2.4 细胞凋亡检测取对数生长期的SW962细胞，以1×108·L-1接种于6孔板内。待细胞贴壁后，加入终浓度分别为0、10、25、50 μmol·L-1的蛇床子素培养24 h，消化后取1 mL细胞悬液，1 000 r·min-1离心5 min，PBS洗涤细胞2次后，每组加入500 μL Binding buffer、5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，并设无FITC、PI空白组，以及FITC或PI单染对照组，避光室温反应5 min后，使用流式细胞仪检测，激发波长488 nm，发射波长530 nm。
1.2.5 Western blot检测蛇床子素对细胞凋亡和PI3K/Akt通路相关蛋白表达的影响取对数生长期的SW962细胞，以1×108·L-1浓度接种于培养皿内。待细胞贴壁后，加入终浓度分别为0、25、50 μmol·L-1的蛇床子素培养基，以及含有与50 μmol·L-1蛇床子素溶液相同浓度的DMSO培养基溶液(0.5%)培养24 h，将各组收集的细胞按照操作说明提取总蛋白。取各组细胞总蛋白样品100 μg，以β-actin(1 :1 000)为内参。经SDS-PAGE凝胶电泳，转印PVDF膜。用含5%脱脂奶粉的TBST封闭2 h后，分别加入Bcl-2(1 :1 000)、Bax(1 :800)、cleaved caspase-3(1 :1 000)、PI3K(1 :3 000)、p-Akt(1 :2 000)抗体，4 ℃孵育过夜。再分别加入HRP标记羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG(1 :1 000)，室温孵育2 h，ECL化学发光。经Image J软件分析，以目的条带和内参的灰度值比值表示蛋白的相对表达水平。
1.2.6 Western blot检测蛇床子素对IGF-1激活的PI3K/Akt通路相关蛋白表达的影响取对数生长期的SW962细胞，以1×108·L-1浓度接种于培养皿内。待细胞贴壁后分3组：(1)加入50 μmol·L-1蛇床子素培养基溶液；(2)200 μg·L-1的rh-IGF-1培养基溶液；(3)50 μmol·L-1蛇床子素及200 μg·L-1 rh-IGF-1培养基溶液。培养24 h，将各组收集的细胞按照操作说明提取总蛋白。操作步骤同“1.2.5”。
1.2.7 统计学处理采用SPSS 19.0软件进行数据分析。实验数据以x±s表示，采用单因素方差分析(ANOVA)，多个样本间的两两比较采用t检验。
2 结果 2.1 蛇床子素抑制SW962细胞增殖Fig 1的MTT结果显示，蛇床子素可以明显抑制SW962细胞的增殖，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。其作用24、48 h的IC50分别为48.75 μmol·L-1和19.47 μmol·L-1。蛇床子素抑制SW962细胞增殖，且呈浓度依赖性。
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| Fig 1 Effect of osthole on proliferation of SW962 cells (x±s, n=6) *P < 0.05, **P < 0.01 vs blank control group |
Fig 2的DAPI染色结果显示，蛇床子素(0、25、50、75 μmol·L-1)处理细胞24 h后，对照组发出均匀淡蓝荧光，细胞核形态正常；蛇床子素组出现核碎裂、染色质聚集等典型凋亡改变，并发出强蓝白色荧光。
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| Fig 2 Effect of osthole on morphology of SW962 cells detected by DAPI (×100) |
如Fig 3所示，蛇床子素(0、10、25、50 μmol·L-1)处理SW962细胞后，与对照组相比，细胞凋亡率明显增加(P＜0.05)。
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| Fig 3 Effect of osthole on apoptosis of SW962 cells detected by FCM (x±s, n=3) *P < 0.05 vs control group |
如Fig 4所示，蛇床子素作用SW962细胞24 h后，促凋亡蛋白Bax和cleaved caspase-3表达明显增加(P＜0.05)；而抑凋亡蛋白Bcl-2表达明显降低(P＜0.05)。
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| Fig 4 Effect of osthole on apoptosis protein expression of SW962 cells detected by Western blot (x±s, n=3) *P < 0.05, **P < 0.01 vs control group |
Fig 5结果显示，蛇床子素作用SW962细胞24 h后，PI3K和p-Akt蛋白表达明显降低(P＜0.05)。
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| Fig 5 Effect of osthole on protein of PI3K/Akt expression of SW962 cells detected by Western blot (x±s, n=3) *P < 0.05, **P < 0.01 vs control group |
Fig 6的结果显示，加入IGF-1刺激SW962细胞24 h后，PI3K、p-Akt和Bcl-2蛋白表达增加(P＜0.05)。同时加入蛇床子素和IGF-1作用于SW962细胞24 h后，PI3K、p-Akt和Bcl-2蛋白表达下调(P＜0.05)。
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| Fig 6 Effect of osthole and IGF-1 on protein of PI3K/Akt expression of SW962 cells detected by Western blot (x±s, n=3) *P < 0.05, **P < 0.01 vs control group |
蛇床子素是一种提取自伞形科植物单体的天然化合物，先前已有研究证实，其在多种癌症中具有抗肿瘤作用。蛇床子素可以诱导骨肉瘤细胞、结肠腺癌细胞、乳腺癌细胞及肺癌细胞凋亡[6-7]，但在外阴鳞癌中尚未见报道。本研究首先通过MTT法检测蛇床子素是否能抑制外阴鳞癌细胞的增殖，结果显示，蛇床子素呈浓度依赖性地抑制外阴鳞癌SW962细胞的增殖。
为了进一步明确蛇床子素抑制SW962细胞生长的具体机制，我们通过DAPI染色和Annexin V-FITC、PI双染流式细胞仪检测蛇床子素对SW962细胞凋亡的影响。结果显示，在DAPI染色实验中，接受蛇床子素处理的细胞固缩，细胞核碎裂或呈分叶状的凋亡形态改变。流式细胞仪检测结果显示，接受蛇床子素处理的SW962细胞总凋亡率明显升高，且随着药物浓度增加，凋亡细胞的数量增多。
细胞凋亡是细胞内程序性的死亡，主要包括内源性线粒体途径和外源性的死亡受体途径。其中，线粒体相关凋亡途径是一个重要的途径。Bcl-2蛋白家族是线粒体凋亡调控的重要因素，包括抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-XL和促凋亡蛋白Bax、Bad等。Bcl-2与Bax结合形成二聚体，发挥抗凋亡作用[8]。Bcl-2/Bax的比值与细胞的存活密切相关，Bcl-2/Bax的比值降低会改变线粒体膜的通透性，引起线粒体膜低电位，释放细胞色素C，形成凋亡复合体，从而激活caspase-3，caspase-3诱导线粒体内源性凋亡途径的激活。本研究通过Western blot法检测Bcl-2、Bax和cleaved caspase-3蛋白，结果显示，蛇床子素作用SW962细胞24 h后，Bcl-2表达明显降低，Bax表达明显增加，Bcl-2/Bax比例下降，cleaved caspase-3蛋白表达明显增加，激活线粒体内源性凋亡途径，从蛋白水平上进一步证明蛇床子素促进SW962细胞凋亡。
PI3K/Akt通路已经被证实参与多种肿瘤的发生、发展过程。最新的研究报道，外阴癌中存在PI3K/Akt/mTOR信号通路异常激活，其可作为外阴癌新的治疗靶点[9]。Akt是PI3K的主要下游靶标，p-Akt被认为是Akt的活性形式，参与调节细胞功能，包括细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡和蛋白质合成，Bcl-2和Bax等作为p-Akt下游的靶点受其调节[10-12]。
本研究发现，蛇床子素抑制PI3K和p-Akt蛋白的表达。为了进一步证实蛇床子素是否通过PI3K/Akt/Bcl-2途径诱导细胞凋亡，我们选取PI3K/Akt通路的经典激活剂IGF-1进行研究[13]。结果发现，IGF-1可激活PI3K/Akt/Bcl-2通路，PI3K、p-Akt和Bcl-2蛋白表达均增加。再加入蛇床子素后，PI3K、p-Akt和Bcl-2蛋白表达均下调，进一步证实蛇床子素通过抑制PI3K/Akt信号通路，诱导SW962细胞凋亡。
( 致谢: 本实验研究在中国医科大学生物科学技术实验室完成，感谢关一夫教授和李硕老师的指导和帮助！)
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