2. 广东医科大学·广东润和生物科技有限公司辅酶Q10联合研究中心，广东 东莞 523808
2. Guangdong Medical University & Guangdong Runhe Biological Technology Co., Ltd. Coenzyme Q10 Research Institute, Dongguan Guangdong 523808, China
骨质疏松是由多种因素导致的骨密度、骨性能质量下降，骨脆性增加，骨组织结构遭到破坏的一种代谢性骨病变[1]。据流行病学调查发现[2-3]，国内(60~70)岁老年人群中，大约有1/3者存在骨质疏松，在绝经后妇女中更常见，但男性骨质疏松症也不容忽视，我国流行病学资料显示，男性骨质疏松的患病率为5.5%~15.5%。研究显示[4-5]，50岁以上的男性每年平均丢失大约0.2%~0.5%的骨量，且男性骨质疏松发生骨折意外后，其危害远远大于女性，即使经过传统骨质疏松疗法治疗后，男性的骨性能康复结果及恢复正常生活的能力明显差于女性。目前，男性骨质疏松动物模型通常采用去睾丸大鼠、小鼠进行造模。但是采用大鼠、小鼠去睾丸所造成的老年男性骨质疏松模型夹杂着心理与生理创伤的影响因素，不能很好地模拟老年男性骨质疏松的正常生理状态[6-7]。本课题前期利用D-半乳糖建立了♂大鼠老年性骨质疏松模型[8-9]，但是D-半乳糖是否能导致♂小鼠发生老年骨质疏松，尚未研究。因此，本研究通过Micro CT探讨D-半乳糖致♂小鼠老年骨质疏松模型的建立。骨化三醇属于骨形成促进药，临床上常用于防治绝经后女性骨质疏松。但是骨化三醇用于老年男性骨质疏松的防治研究尚少。因此，本研究通过Micro CT等方法，在微观结构上观察骨化三醇对老年男性骨质疏松的影响，为男性骨质疏松的用药治疗提供参考依据。
1 材料与方法 1.1 实验动物17周龄SPF级♂昆明小鼠30只，体质量(35~40) g，普通级动物饲养房内饲养，动物在实验前适应周围环境1周，普通颗粒维持饲料喂养，饮用过滤后清洁自来水，每笼10只。小鼠购自南方医科大学动物中心，合格证号：SYXK(粤)2015-0147。
1.2 药物与试剂骨化三醇，购于Hoffmann-La Roche AG，批号：B2166B05。D-半乳糖，购于索莱宝，批号：923C057。
1.3 仪器Viva Micro CT 40(SCANCO Medical AG)；AE240电子天平(梅特勒·托利多仪器公司上海分公司)；数控超声波清洗器KQ-250DE(昆山超声仪器有限公司)；858 Mini Bionix型材料测试系统(美国MST公司)。
1.4 实验动物的分组与给药取上述小鼠，根据体质量按随机区组法即配伍分组法原则，先将动物区分为若干个区组，然后将各区组通过Excel软件的随机函数Rand平均分配到3组，每组10只，具体为：①正常对照组：灌胃给予生理盐水，并背部注射生理盐水；② D-半乳糖模型组：按150 mg·kg-1·d-1，每天背部皮下注射D-半乳糖(用生理盐水溶解D-半乳糖，浓度为0.083 mol·L-1)，并灌胃给予生理盐水，连续12周；③骨化三醇组：造模方法同模型组，然后按0.076 μg·kg-1·d-1灌胃骨化三醇混悬液(0.25 μg骨化三醇配成33.3 mL的混悬液)。所有小鼠于适应性喂养1周后开始给药，连续给药12周。7 d称体质量1次，并按体质量变化调整给药量，实验过程中观察小鼠的生存活动情况并记录。实验结束时，采用眼球取血处死小鼠。取双侧股骨做Micro CT扫描以及生物力学三点弯曲实验[9]。
1.5 观察指标及测定方法 1.5.1 小鼠体质量的观察7 d称小鼠体质量1次，实验第12周，在取材前12 h撤掉饲料，禁食不禁水，取材前称重，作为实验结束时的最终体质量。
1.5.2 Micro CT对小鼠股骨的分析将小鼠股骨附着组织剔除干净，放入Micro CT仪，对左股骨干骺端进行X射线扫描。viva CT40选择扫描参数:能量/强度为70 kVP，114 μA，8 W，扫描时间为29.7 min，片数Slice为505。扫描完成后，选取距生长板远端1.0 mm、层厚2.0 mm的骨组织为松质骨感兴趣区域(region of interest, ROI)行三维重建，以最低阈值为150提取图像信息。使用其软件(SCANCO Medical AG)进行重建定量分析。参数如下：连接密度(connectivity density, Conn.D.)、结构模型指数(structure model index, SMI)、骨密度(bone mineral density, BMD)、骨体积分数(bone volume/tissue volume, BV/TV)、骨小梁数量(trabecular number, Tb.N)、骨小梁厚度(trabecular thickness, Tb.Th)、骨小梁分离度(trabecular separation, Tb.Sp)。
1.5.3 小鼠股骨的生物力学分析测试时，将在70%乙醇中保存的右股骨，用纱布吸干液体，进行预实验，调试完毕可进行正式实验。实验时，用858 Mini Bionix型材料测试系统进行三点弯曲实验，分析左侧股骨的的生物力学性能。把小鼠股骨放在MTS实验机上，加载速度为0.155 mm·s-1，跨距5 mm。绘制应力－应变曲线，从曲线上读取数据，根据相应的公式计算参数指标：最大载荷(maximum load)、断裂载荷(break load)、弹性载荷(elastic load)、刚度(stiffness)等。
1.6 统计学分析实验数据均用x±s表示，采用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析(ANOVA)，若Levene检验方差齐性，则组间采用LSD检验；若方差不齐则采用welch校正后做方差分析，组间采用Dunnett's T3多重检验。
2 结果 2.1 各实验组小鼠体质量的变化实验前，各组间小鼠体质量差异无统计学意义(P>0.05)。实验后，不同时间点及结束时，各组间小鼠体质量差异仍无统计学意义(P>0.05)。见Tab 1。
| Group | 0 W | 2 W | 4 W | 6 W | 8 W | 10 W | 12 W |
| Control | 32.46±4.04 | 46.53±2.77 | 46.14±2.46 | 44.56±2.76 | 44.56±2.45 | 45.46±3.05 | 45.31±2.73 |
| Model | 31.08±3.66 | 45.23±3.39 | 43.19±3.50 | 41.52±3.67 | 43.19±3.08 | 45.75±3.09 | 45.37±3.13 |
| Calcitriol | 32.84±4.07 | 46.30±3.12 | 46.68±3.60 | 45.85±4.20 | 46.55±4.01 | 46.78±3.70 | 46.96±5.01 |
Fig 1为各组小鼠股骨Micro CT的2D图和3D图。SEG(Segmented)图反映骨小梁的数量，TH(Trabecular thickness)图反映骨小梁的厚度分布情况，颜色从绿到红，反映骨骨小梁从薄到厚；二维图(2D image)可见骨髓腔内骨小梁数量。从图中可见，正常对照组小鼠股骨骨小梁较粗，空隙较小，数量较多，连续性较好；模型组小鼠股骨出现了骨小梁的断裂、变短、网状结构退化，而且在中央还出现较大的空隙。骨化三醇组小鼠股骨的骨小梁之间的空隙较小，且均匀、有序、紧密，连续性较好，且与正常对照组比较差异无显著性。
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| Fig 1 2D reconstruction of Micro CT and ROI region 3D reconstruction of mouse femur |
Tab 2记录了各实验组小鼠股骨Micro CT扫描参数的变化情况。从结果可见，与正常对照组相比，模型组股骨Micro CT指标的Conn.D.、BMD、BV/TV和Tb.N均降低(P < 0.05)，SMI增加(P < 0.05)。与模型组相比，骨化三醇组股骨Micro CT指标的BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th均增加(P < 0.05)，而SMI降低(P < 0.05)。
| Parameter | Control | Model | Calcitriol |
| Conn.D./1·mm-3 | 43.61±30.04 | 13.92±8.85* | 41.01±30.11 |
| SMI | 1.83±0.57 | 2.55±0.56* | 1.76±0.68# |
| BMD/g·cm-2 | 91.11±35.43 | 25.61±4.57* | 138.16±62.46# |
| BV/TV/% | 0.143±0.07 | 0.055±0.036* | 0.196±0.133# |
| Tb.N/mm-1 | 2.31±0.99 | 0.95±0.61* | 2.40±1.35# |
| Tb.Th/mm | 0.061±0.007 | 0.056±0.011 | 0.077±0.016*# |
| Tb.Sp/mm | 0.46±0.25 | 1.42±1.62 | 0.37±0.24 |
| *P < 0.05 vs control group; #P < 0.05 vs model group | |||
Tab 3结果显示，与正常对照组比较，模型组小鼠股骨生物力学参数弹性载荷、最大载荷、断裂载荷、有下降趋势，但差异均无统计学意义(P>0.05)。骨化三醇组股骨生物力学参数断裂载荷、最大载荷、刚性系数均增加(P < 0.05)，说明骨化三醇可明显增加♂老年小鼠的股骨生物力学性能。与模型组比较，骨化三醇组断裂载荷、弹性载荷、最大载荷和刚性系数均增加，说明骨化三醇可明显增加D-半乳糖♂老年小鼠的股骨生物力学性能。
| Group | Break load/N | Maximum load/N | Elastic load/N | Stiffness/N·mm-1 |
| Control | 25.33±3.20 | 25.79±2.74 | 18.52±3.30 | 150.27±25.52 |
| Model | 22.84±4.01 | 24.01±3.11 | 16.13±1.43 | 158.87±29.63 |
| Calcitriol | 36.28±4.46*# | 36.80±4.43*# | 21.94±5.69# | 216.23±43.61*# |
| *P < 0.05 vs control; #P < 0.05 vs model | ||||
本实验发现，在实验结束时，D-半乳糖小鼠体质量与模型组差异无统计学意义，说明D-半乳糖对小鼠体质量无明显影响。从结果可见，与正常对照组相比，模型组股骨Micro CT指标的Conn.D.、BMD、BV/TV和Tb.N分别降低了68.08%、71.89%、61.54%和58.87%，而SMI上升39.34%，说明D-半乳糖可以降低正常生长♂小鼠股骨的骨密度，并使骨小梁由杆状结构转变为板状结构，使骨微结构受到破坏。小鼠股骨Micro CT的ROI区三维重建图中，模型组出现了骨小梁断裂，变短，网状结构退化，而且在中央还出现较大的间隙，这表明♂小鼠给予D-半乳糖12周后，小鼠股骨的骨量明显减少，骨微观结构受到破坏。与正常对照组比较，模型组小鼠股骨生物力学参数弹性载荷、最大载荷、断裂载荷有下降趋势，但均无统计学差异，说明D-半乳糖对♂小鼠股骨生物力学性能影响不大。D-半乳糖引起衰老的原因与机体新陈代谢障碍问题相关联，如果在一定时间内，连续给予动物注射一定量的D-半乳糖，短期内可使机体细胞内半乳糖浓度迅速增高，在醛糖还原酶的催化下还原成半乳糖醇，后者不能被细胞进一步代谢而蓄积在细胞内，影响细胞的正常渗透压，导致细胞肿胀和功能障碍，最终引起衰老。D-半乳糖引起小鼠骨质疏松症的机制也类似衰老机制，由于皮下大剂量注射D-半乳糖，可在小鼠体内经氧化酶分解为CO2和木酮糖，并伴有大量氧自由基和H2O2的产生，若体内大量蓄积的过氧化物不能及时清除，则导致各种细胞的氧化损伤，影响了骨细胞的正常代谢，使骨的微观结构出现缺陷，并影响到骨的生物力学功能，从而造成低转换型的骨质疏松。男性骨质疏松多属于低转换型，实验结果说明，皮下注射D-半乳糖可建立♂小鼠低转换型骨质疏松模型。
本研究还发现，与模型组相比，骨化三醇组股骨Micro CT指标的BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th分别增加4.39倍、2.56倍、1.52倍和0.38倍，而SMI降低了30.98%，表明骨化三醇可以明显改善D-半乳糖♂衰老小鼠骨丢失的情况，使骨小梁结构由板状转变为杆状，预防骨小梁微观结构的损伤。小鼠股骨Micro CT的ROI区三维重建图中，骨化三醇组的骨小梁间隙较小，连续性较好，排列均匀、有序、紧密。以上结果表明，骨化三醇可增加D-半乳糖♂老年小鼠股骨的骨量，微观结构得到改善。因为骨化三醇具有明显增加D-半乳糖♂小鼠股骨的骨量，从而使得D-半乳糖♂小鼠股骨生物力学性能指标得到改善。与正常对照组相比，骨化三醇组股骨Tb.Th明显增加，说明骨化三醇还可以使♂小鼠股骨的骨小梁厚度超过正常生长的小鼠，具有明显的改善骨微观结构的作用。与正常对照组相比，骨化三醇组的断裂载荷、最大载荷、刚性系数分别上升43.23%、42.69%、43.89%。与模型组比较，骨化三醇组的断裂载荷、弹性载荷、最大载荷和刚性系数分别上升58.84%、53.27%、36.02%和36.10%，说明骨化三醇可明显增加正常小鼠和D-半乳糖♂小鼠的股骨生物力学性能。临床药理学研究发现，小剂量活性维生素D3可促进肠道钙的吸收、成骨细胞活性，以及抑制骨细胞活性，临床主要用于妇女绝经后骨质疏松症。骨化三醇是维生素D3的最重要活性代谢产物之一，在调节钙平衡方面发挥着非常重要的作用，可促进骨盐沉着及骨样组织成熟，加快骨质的新陈代谢，促进新骨的形成，有效增加骨密度[10-11]。骨化三醇可抑制吸收亢进，促进肠钙吸收，对胶原分解形成抑制，可在一定程度上减轻骨质疏松性骨痛[12]。有报道[13-14]，骨化三醇除具有传统观点上升高血钙、改善骨形成的作用外，还具有免疫调节的功能。活性维生素D3对骨质疏松的临床研究大多以绝经后妇女居多，对男性骨质疏松患者的研究报道还不多[15]。本研究结果为应用骨化三醇防治男性骨质疏松提供实验依据，并为解决男性骨质疏松的治疗难题提供可应用的治疗药物参考依据。
( 致谢：本实验在广东医科大学药学院药理学实验室完成，感谢各位老师和同学的帮助。)
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