血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)由激活的巨噬细胞、血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)和内皮细胞产生，形成3个亚型(AA、AB、BB)，在各种血管疾病的发病和发展中起着重要作用[1-2]。PDGF-BB引起VSMCs过度增殖是动脉粥样硬化和相关血管疾病的标志[3]。因此，抑制PDGF-BB诱导的VSMCs增殖是预防和治疗血管疾病的重要策略。PDGF-BB与PDGF受体结合，激活PI3K/Akt、磷脂酶Cγ1(phospholipase Cγ1，PLCγ1)和细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2)信号转导途径[1]。因此，抗增殖作用可能通过调控PI3K/Akt、PLCγ1、ERK1/2信号通路而实现。VSMCs增殖是由细胞周期控制的，细胞周期包括处于休止期(G0)和细胞生长间期即DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)、DNA合成后期(G2期)、细胞分裂期(M期)[2]。
紫草醌是从中药紫草中提取的一种萘醌类化合物，对大鼠VSMCs有抗增殖活性，研究者报道了紫草醌抑制TNF-α诱导的大鼠VSMCs生长[4]。一些萘醌类衍生物具有抗增殖活性。2-氯-3-(4-苯基)-氨基1，4-萘醌抑制了胎牛血清诱导的大鼠主动脉VSMCs增殖。2-氯-3-[4-(乙基羧基)-苯基)]-氨基-1，4-萘醌抑制了PDGF-BB刺激的大鼠主动脉VSMCs DNA合成，并通过抑制PDGFβ受体(PDGFRβ)的活性而抑制细胞周期进程[3]。
在本研究中，我们实验室合成的一系列萘醌衍生物中的2-壬基硫酰-5, 8-二甲氧基-1, 4-萘醌(2-nonylsulfinyl-5, 8-dimethoxy-1, 4-naphthoquinone, 2-nonylsulfinyl-DMNQ, 结构见Fig 1)，表现出抑制由PDGF-BB刺激的大鼠主动脉VSMCs增殖的活性。为了研究萘醌类化合物潜在的抗VSMCs增殖的作用机制，本课题对PDGF-BB介导的相关信号通路如ERK1/2、Akt、PLCγ1、PDGFβ受体，以及细胞周期进程和细胞周期调控蛋白进行了研究。
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| Fig 1 Chemical structure of 2-nonylsulfinyl-5, 8-dimethoxy-1, 4-naphthoquinone(2-nonylsulfinyl-DMNQ) |
2-nonylsulfinyl-DMNQ，由本实验室合成，纯度>98%。PDGF-BB购自Upstate Biotechnology公司；抗体GAPDH、p-Akt1/2/3(Ser 473)-R、Akt，购自Santa Cruz生物技术公司；抗体p-PDGFRβ(Tyr751)、p-p44/42 MAPK(ERK1/2) (Thr202/Tyr204)、p-PLCγ1(Tyr783)、PDGFRβ、p44/42 MAPK(ERK1/2)、PLCγ1，均购自Cell Signaling Technology公司；Akt抑制剂LY294002，购自Cayman Chemical公司；PDGFRβ抑制剂AG1295、ERK抑制剂U0126、PLCγ抑制剂U73122，均购自Sigma-Aldrich公司；Premix WST-1细胞增殖测试试剂盒，购自TaKaRa公司；其他化学试剂均为分析级。
1.2 细胞株大鼠主动脉血管平滑肌细胞A10，型号FS-1629，购自美国菌种保存中心(American Type Culture Collection，ATCC)。
1.3 仪器IFS-110-8型CO2恒温培养箱(新加坡Esco Micro Pte有限公司)；Multiskan Go型全波长酶标仪(美国赛默飞世尔科技有限公司)；LS3801型液体闪烁计数器(德国Beckman Düsseldorf公司)；FACS Calibur型流式细胞仪(美国Becton Dickinson公司)；ChemiDoc XRS凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)。
2 方法 2.1 细胞培养A10细胞用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基，在37 ℃、5% CO2培养箱中培养，第5~9代的细胞用于实验。
2.2 细胞增殖实验采用非放射性比色法WST-1和细胞计数法，测定了2-nonylsulfinyl-DMNQ对A10细胞的抗增殖作用。以2.5×107·L-1的浓度将A10细胞接种于96孔培养板，并在含10% FBS的DMEM培养液中培养24 h。接着用无血清的DMEM培养液培养24 h后，再分别用含0.1、0.5、1 μmol·L-1 2-nonylsulfinyl-DMNQ的无血清DMEM培养液处理24 h，再加入25 μg·L-1的PDGF-BB培养22 h，最后加入WST-1培养2 h后，于450 nm波长下测定细胞光密度。
进一步用细胞计数实验证明2-nonylsulfinyl-DMNQ的抗增殖作用。以5×107·L-1的浓度将A10细胞接种于6孔培养板，并在含10% FBS的DMEM培养液中培养24 h，再用无血清DMEM培养液培养24 h，接着分别用0.1、0.5、1 μmol·L-1的2-nonylsulfinyl-DMNQ处理24 h后，用25 μg·L-1的PDGF-BB处理24 h。最后，细胞用胰蛋白酶-EDTA消化，置于显微镜下，使用血细胞计数器计数细胞个数。
为排除假阳性，使用WTS-1试剂盒测试2-nonylsulfinyl-DMNQ对A10细胞的细胞毒性, 洋地黄毒苷(25 μmol·L-1)作为对照药物。A10细胞在无血清DMEM培养液中培养24 h后，分别加1 μmol·L-1 2-nonylsulfinyl-DMNQ处理0、3、6、12、24、48 h，而后细胞加入WST-1培养2 h，于450 nm波长下测定和记录相应的光密度值。
2.3 [3H]胸腺嘧啶核苷参入实验参照文献方法[5]，利用[3H]胸腺嘧啶核苷参入法测定2-nonylsulfinyl-DMNQ对DNA合成的作用。A10细胞用25 μg·L-1的PDGF-BB处理20 h后，再用1 mCi·L-1 [3H]胸腺嘧啶核苷处理4 h。使用液体闪烁计数器来量化[3H]胸腺嘧啶核苷的参入量。
2.4 细胞周期进程分析按照文献描述方法[5]确定细胞周期。用0.1、0.5、1 μmol·L-1的2-nonylsulfinyl-DMNQ处理A10细胞24 h，再用25 μg·L-1的PDGF-BB刺激24 h后收集、清洗细胞，然后用70%乙醇于4 ℃固定30 min。再将细胞混匀后离心，弃去上清液，在室温下将细胞放置于300 μL的碘化丙锭溶液(50 mg·L-1碘化丙锭的样品缓冲液中含有100 mg·L-1核糖核酸酶A)15 min。每个细胞核的碘化丙锭-DNA复合体用流式细胞仪测量。通过程序Modfit LT分析确定细胞周期G0/G1、S和G2/M阶段的比例。
2.5 免疫印迹分析参照文献方法[5]进行免疫印迹分析。将A10细胞以5×107·L-1的浓度接种于6孔培养板，用含10% FBS的DMEM培养24 h，再用无血清的DMEM培养24 h，接着分别用2-nonylsulfinyl-DMNQ(0.1、0.5、1 μmol·L-1)、10 μmol· L-1 ERK1/2抑制剂U0126[6]、10 μmol·L-1 PI3K抑制剂LY294002[7]、20 μmol·L-1 PLCγ抑制剂U73122[8]、20 μmol·L-1 PDGFRβ抑制剂AG1295[9]处理24 h。用25 μg·L-1的PDGF-BB刺激A10细胞15 min后，检测ERK1/2、Akt、PLCγ1和PDGFRβ的磷酸化水平。蛋白样品用SDS-PAGE分离，分别使用相应的抗体进行免疫印迹分析，使用ChemiDoc XRS成像系统和Bio-Rad的MultiAnalist软件对免疫印迹分析中的条带进行密度可视化和测量。
2.6 统计学处理所有实验数据均以x±s表示, 用ANOVA进行统计学检验。
3 结果 3.1 2-nonylsulfinyl-DMNQ对A10细胞增殖的影响如Fig 2A所示，与无血清培养液对照组相比，经过25 μg·L-1的PDGF-BB刺激后的A10细胞生长明显加快，2-nonylsulfinyl-DMNQ以浓度依赖的方式抑制PDGF-BB引起的A10细胞增殖。Fig 2B细胞计数实验结果显示，与无刺激组(5.7×107·L-1)相比，25 μg·L-1 PDGF-BB处理组(12.4×107·L-1)细胞的数量明显增加；经2-nonylsulfinyl-DMNQ(0.1、0.5、1 μmol·L-1)处理，细胞明显减少至8.4×107·L-1、7.5×107·L-1、6.9×107·L-1。图 2C结果显示，细胞经过1 μmol·L-1 2-nonylsulfinyl-DMNQ处理48 h后，并未出现任何细胞毒性，提示2-nonylsulfinyl-DMNQ抗细胞增殖的作用不是由于细胞毒性。
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| Fig 2 Effect of 2-nonylsulfinyl-DMNQ on PDGF-BB-induced proliferation of A10 cells(x±s, n=4) A:WST-1 assay. A10 cells proliferation stimulated by 25 μg·L-1 PDGF-BB was determined in the presence of 2-nonylsulfinyl-DMNQ(0.1, 0.5, 1 μmol·L-1); B:Cell counting. Treated with 2-nonylsulfinyl-DMNQ(0.1, 0.5, 1 μmol·L-1) for 24 h and then stimulated by PDGF-BB for 24 h, A10 cells were trypsinized and counted using hemocytometer; C: Cell viability. Cytotoxic effect of 1 μmol·L-1 2-nonylsulfinyl-DMNQ on A10 cells was evaluated after treatment for 0, 3, 6, 12, 24 and 48 h. Optical density of blank control group was set as 100%. Digitonin(25 μmol·L-1) was chosen as control drug.*P < 0.05, **P < 0.01 vs PDGF-BB group. |
PDGF-BB引起[3H]胸腺嘧啶核苷参入由641 cpm/孔增加到4 358 cpm/孔。经过2-nonylsulfinyl-DMNQ(0.1、0.5、1 μmol·L-1)处理，明显抑制了PDGF-BB引起的[3H]胸腺嘧啶核苷进入DNA，抑制率分别是16.6%、43.3%、66.9%(Fig 3A)。
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| Fig 3 Effect of 2-nonylsulfinyl-DMNQ on DNA synthesis(x±s, n=4) A:[3H] thymidine incorporation.[3H] thymidine uptake into DNA of A10 cells was quantified using a liquid scintillation counter; B: Cell cycle progression. The individual nuclear DNA content was reflected by fluorescence intensity of incorporated PI. Each item was derived from a representative experiment, where data from at least 10, 000 events were obtained.**P < 0.01 vs PDGF-BB group. |
通过细胞周期的分布(Fig 3B)可以看出，PDGF-BB引起S期细胞的比例由7.4%增加到14.9%。2-nonylsulfinyl-DMNQ处理能阻止细胞周期进程，减少处于S期细胞的百分比，其抗细胞增殖作用与增加处于G0/G1的细胞有关。
3.4 2-nonylsulfinyl-DMNQ对PDGF-BB引起的Akt、PLCγ1、PDGFRβ磷酸化的作用Fig 4结果显示，PDGF刺激的ERK1/2磷酸化水平被10 μmol·L-1 ERK抑制剂U0126降低到PDGF-BB诱导的对照组的39.1%；用2-nonylsulfinyl-DMNQ(0.5、1 μmol·L-1)处理后，ERK1/2磷酸化水平分别降低到74.3%和51.6%。1 μmol·L-1 2-nonylsulfinyl-DMNQ和10 μmol·L-1 PI3K抑制剂LY294002处理细胞后, 均明显抑制了由PDGF-BB引起的Akt磷酸化。20 μmol·L-1 PLCγ1抑制剂U73122明显降低由PDGF-BB介导的PLCγ1磷酸化水平，降低至PDGF-BB刺激对照组的3.3%；2-nonylsulfinyl-DMNQ在0.1~1 μmol·L-1浓度范围内，明显降低了PLCγ1磷酸化水平。20 μmol·L-1 PDGFRβ抑制剂AG1295处理后，PDGF-BB刺激的PDGFRβ磷酸化水平被明显抑制到PDGF-BB刺激对照组的14.7%；2-nonylsulfinyl-DMNQ(0.5、1 μmol·L-1)均能明显抑制PDGFRβ磷酸化水平。
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| Fig 4 Effect of 2-nonylsulfinyl-DMNQ on PDGF-BB stimulated phosphorylation of ERK1/2(A), Akt(B), PLCγ1(C) and PDGFRβ(D)(x±s, n=4) **P < 0.01 vs PDGF-BB group |
动脉壁中VSMCs的过度增殖是血管疾病的重要病理因素[10]。因此，抑制VSMCs增殖是针对这类疾病的重要治疗策略之一[11]。本研究结果显示，2-nonylsulfinyl-DMNQ明显抑制PDGF-BB引起的VSMCs增殖、DNA合成，其抗增殖作用与G0/G1期抑制有关。
PDGF-BB与PDGF受体结合，导致PDGFRβ酪氨酸残基磷酸化，刺激PI3K/Akt、ERK1/2和PLCγ1的激活[1, 3]。PDGF、Akt、ERK1/2和PLCγ1的磷酸化水平降低可能会抑制PDGF-BB刺激的VSMCs增殖。ERK1/2是细胞生长早期细胞内的有丝分裂信号转导的重要参与者，并且与PDGF-BB诱导的各种细胞类型的增殖有关。Akt是另一个与PDGF-BB介导的增殖有关的下游信号。本实验结果表明，2-nonylsulfinyl-DMNQ以浓度依赖性的方式抑制PDGF-BB刺激的ERK1/2、Akt、PLCγ1、PDGFRβ的磷酸化，提示其抗增殖作用可能通过抑制上述信号分子的磷酸化来调节。
综上所述，2-nonylsulfinyl-DMNQ通过抑制ERK、Akt、PLCγ1和PDGFRβ路径，通过在G0/G1期阻滞细胞周期进入S期，从而减少了DNA合成，最终抑制了PDGF-BB诱导的VSMCs增殖。因此，2-nonylsulfinyl-DMNQ可能具有通过抑制VSMCs增殖来预防和治疗动脉粥样硬化的潜力。深入探索2-nonylsulfinyl-DMNQ抑制VSMCs增殖的作用机制，将为该化合物在防治动脉粥样硬化的应用提供实验依据。
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