2002年河南省启动国家艾滋病免费抗病毒治疗（ART），是全国艾滋病患者较多和ART开展较早的省份之一。随着ART时间延长，依从性的下降，部分患者出现了ART失败。为应对ART失败，2009年河南省开始使用含有洛匹那韦/利托那韦的二线ART方案。但洛匹那韦/利托那韦存在腹泻、高脂血症、血糖异常等不良反应，且与多种慢性疾病的药物存在着药物相互作用，在一定程度上会影响ART依从性和ART疗效。整合酶抑制剂（INSTIs）具有强效抑制病毒、高耐药屏障、药物不良反应小、药物相互作用少的优势。河南省从2017年底开始陆续使用多替拉韦等INSTIs药物，更换洛匹那韦/利托那韦以减少其副作用，在改善ART耐受性和依从性的同时，极大地提高ART成功率。截至2020年底，河南省在治艾滋病患者60 521人，ART成功率达94.7%^[1]（病毒载量 < 1 000拷贝数/ml）。但是，由于河南省艾滋病患者ART时间较长和人数较多，而且绝大多数患者在县或县级以下定点医疗机构接受ART或在外长期务工，存在着ART失败和耐药的风险。为了更好地管理ART失败和耐药患者，郑州市第六人民医院自2018年开展耐药检测工作，免费为河南省ART失败患者进行基因型耐药检测（GRT）。本研究分析河南省ART失败艾滋病患者耐药特征，为河南省应对HIV-1耐药提供参考依据。

1. 研究对象：2018年1月至2021年5月河南省18个城市接受ART的艾滋病患者。纳入标准：①ART时间≥6个月；②病毒载量≥1 000拷贝数/ml；③ART停药≤4周；④基本信息完整；⑤签署知情同意书。本研究已通过郑州市第六人民医院伦理委员会审查（批准文号：2019-04）。

2. 研究方法：

（1）一般资料：收集艾滋病患者血液样本、社会人口学特征和ART信息。内容包括性别、年龄、职业、感染途径、ART方案，耐药检测时最近1次CD4⁺T淋巴细胞（CD4）计数和病毒载量。人口学资料来源于HIV-1耐药登记记录，ART信息来源于国家ART数据库。血样标本均在门诊或住院部抽取。

（2）采用In-house方法进行HIV-1基因型耐药检测：均在郑州市第六人民医院转化医学研究中心完成。①HIV-1 RNA的提取与核酸扩增：按照标准操作程序，应用上海之江生物科技股份有限公司的核酸提取试剂盒（磁珠法）进行RNA的提取。以HIV-1 pol区蛋白酶（全长）、反转录酶（1~318个氨基酸）和整合酶基因（全长）为扩增区域，使用巢式PCR方法进行PCR扩增，扩增使用LA Taq™ Version 2.0（TaKaRa，Shiga，日本）DNA聚合酶。蛋白酶及反转录酶区域巢式PCR第一轮引物为PRO-F1和RT-R1，第二轮PCR引物为PRO-F2和RT-R2，对应目的片段长度约1 300 bp。整合酶区域巢式PCR第一轮引物为F4181和R5073，第二轮PCR引物为F4379和R5057，对应目的片段长度约700 bp。引物序列见表 1。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳初步鉴定后，阳性样本送上海生工生物公司进行纯化和测序。②序列拼接与处理：使用DNAMAN和Chromas软件对目的基因序列进行拼接和分析，包括反转录酶区域、蛋白酶区域和整合酶区域的耐药突变位点。③耐药分析：耐药定义为任何一种ART药物出现低度及以上耐药。将得到的完整序列提交斯坦福大学的HIV-1耐药数据库（http://hivdb.stanford.edu/）在线网站分析，参照WHO的耐药突变位点列表，确定耐药突变位点和对各种ART药物的耐药程度。

表 1 本研究的引物序列

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3. 统计学分析：采用SPSS 25.0软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料采用x±s表示；偏态分布计量资料用M（Q₁，Q₃）表示，比较采用秩和检验；计数资料用例数和百分数表示，比较采用χ²检验。双侧检验，检验水准α=0.05。

1. 患者基本情况及耐药检测结果：

（1）患者基本情况：在887例ART失败的艾滋病患者中，样本成功扩增率为91.54%（812/887）。812例患者年龄（42.10±15.02）岁，年龄范围5~77岁，男性占73.28%（595/812），农民/农民工占44.70%（363/812），传播途径以性传播为主（52.34%，425/812），ART时间M（Q₁，Q₃）为5.18（1.96，9.77）年，ART方案以2个核苷类反转录酶抑制剂（NRTIs）联合非核苷类反转录酶抑制剂（NNRTIs）方案为主（73.40%，596/812）。最近1次CD4计数M（Q₁，Q₃）为76（22，200）个/μl，范围1~1 647个/μl。见表 2。

表 2 河南省抗病毒治疗（ART）失败艾滋病患者社会人口学特征和耐药检测结果

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（2）耐药检测结果：在完成NRTIs、NNRTIs和蛋白酶抑制剂（PIs）的耐药检测812例患者中，完成INSTIs耐药检测663例，原因是2019年之前尚未全部开展INSTIs耐药检测。总的耐药率为83.25%（676/812），其中NRTIs、NNRTIs、PIs和INSTIs耐药率分别为73.40%（596/812）、80.54%（654/812）、5.54%（45/812）和2.56%（17/663），4类药物的耐药率差异有统计学意义（χ²=1 686.34，P < 0.001）。对2类药物同时耐药率为66.38%（539/812），对3类药物同时耐药率为5.79%（47/812）。在耐药≥2类药物者中，以NRTIs和NNRTIs同时耐药为主（71.67%，582/812）。

共检出9个HIV-1基因亚型，以B亚型为主（59.61%，484/812），其次为CRF01_AE亚型（22.17%，180/812）和CRF07_BC亚型（9.48%，77/812），不同基因亚型耐药率的差异有统计学意义（χ²=21.33，P=0.001）。不同的年龄、ART时长、ART方案和最近1次CD4计数的耐药率的差异有统计学意义（均P < 0.05）。见表 2。

2. 不同基因亚型对抗病毒药物的耐药情况：不同基因亚型对NRTIs和NNRTIs耐药率不同，差异均有统计学意义（χ²=31.14和χ²=27.36，均P < 0.001），A亚型耐药率最高，其次是CRF55_01B和CRF01_AE；不同基因亚型对PIs和INSTIs耐药率的差异无统计学意义（χ²=9.73，P=0.083；χ²=1.67，P=0.948）。见表 3。

表 3 不同基因亚型的耐药情况

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3. 耐药突变位点和耐药突变：共检出67个耐药突变位点，其中NRTIs相关突变位点17个，包括184、65、70、215、67、115、41、151等，M184V/I突变率最高达63.42%（515/812），其次是K65R（27.46%，223/812）、K70R（23.28%，189/812）、T215Y（16.5%，134/812）。M184V/I且K65/R突变率为（21.67%，176/812），≥1个TAMs（基因位点41、67、70、210、215、219）突变率为50.25%（408/812），M184V/I且TAMs突变率为42.98%（349/812）。NNRTIs相关耐药突变位点17个，主要有103、190、106、181、179、221、101等。突变率位居前5位的分别是主要突变K103N/S（34.98%，284/812）、G190A/S（26.11%，212/812）、V106M/I（24.63%，200/812）、Y181C/I（24.14%，196/812）和次要突变V179D/E（20.81%，169/812）。PIs相关耐药突变位点21个，主要是46、82、54、33、10、47、58等，主要突变M46I、V82A/F、I54V/MV突变率分别为4.31%（35/812）、3.82%（31/812）、3.69%（30/812），次要突变L33F、L10F/FI突变率分别为1.97%（16/812）、1.85%（15/812），M46I、I54V和V82A同时突变率为1.60%（13/812）。INSTIs相关耐药突变位点12个，主要为157、263、140、138、163、97、155等，次要突变E157 Q/EQ突变率最高（3.47%，23/663），而主要突变R263K（0.75%，5/663）、G140A（0.75%，5/663）、E138EK（0.60%，4/663）突变率低。

4. 抗病毒药物耐药程度：在NRTIs中，拉米夫定和恩曲他滨耐药程度一致，以高度耐药为主（65.52%，532/812）；阿巴卡韦和替诺福韦中/高度耐药分别占58.74%（477/812）和42.86%（348/812）；齐多夫定的中/高度耐药占比最低（18.35%，149/812）。在NNRTIs中，奈韦拉平（77.46%，629/812）和依非韦伦（71.18%，578/812）以高度耐药为主；多拉韦林和利匹韦林的中/高度耐药分别占56.77%（436/768）和46.80%（380/812）。在PIs中，洛匹那韦/利托那韦中/高度耐药占比仅为4.19%（34/812）。INSTIs中，艾维雷韦和拉替拉韦耐药程度比较一致，中/高度耐药分别占1.66%（11/663）和1.21%（8/663），未发现比克替拉韦和多替拉韦的高度耐药。见表 4。

表 4 主要抗病毒治疗药物的不同耐药程度

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本研究发现，2018-2021年河南省艾滋病患者ART失败的耐药率（83.25%）高于我国报道的ART失败耐药率（57.00%）^[2]，也高于河南省前期报道的耐药率（78.21%）^[3]。ART时间 < 1年者的耐药率高于ART≥5年者，与河南省前期报道耐药结果不一致^[4]，可能与近年来河南省ART前的非核苷类药物耐药率增加有关^[5]，提示须加强ART前的耐药检测。在ART药物中，2个核苷类药物联合非核苷类药物方案的耐药率高于2个核苷类药物联合PIs/INSTIs方案，这与PIs/INSTIs具有强效抑制病毒和高耐药屏障有关。因此，选择高耐药屏障药物方案，有助于降低耐药发生，提高ART成功率。ART失败且CD4计数 < 100个/µl患者的耐药率较高，提示ART失败后，如不及时干预，在病毒学突破基础上，容易继发出现CD4计数下降，导致更多基因突变的积累，引起更广泛的耐药^[6-7]。为避免更多的耐药，建议加强ART后的病毒载量检测，尽早发现病毒学失败和及时更换用药方案。

河南省ART失败患者的HIV-1基因亚型以B亚型为主，与河南省早期报道的结果一致^[8]，但国内其他省份报道以CRF01_AE和CRF07_BC亚型为主^[9-10]。不同的HIV-1基因亚型，对ART药物的反应和敏感性存在一定差异，会带来不同的耐药风险^[11]。本研究发现，A亚型虽然耐药率最高，但该亚型在河南省占比较少。CRF01_AE和CRF55_01B亚型在河南省占有一定比例，耐药率均高于B和CRF07_BC亚型，与姚之莹等^[12]报道的CRF01_AE耐药率高于其他亚型和Lan等^[13]报道CRF55_01B耐药率达79.01%的结果基本一致。

核苷类耐药中，M184V/I突变率最高，其次为K65R，与国内外的研究结果一致^{[9, 14]}。本结果显示：由于有多个核苷类药物耐药突变并存的情况，如M184V/I且K65R突变、M184V/I且TAMs突变，可能导致更多核苷类药物产生更高程度的耐药^[15]。其中拉米夫定以高度耐药为主，阿巴卡韦、替诺福韦的中、高度耐药占50%左右。

非核苷类耐药中，突变率较高的是K103N/S、G190A/S、V106M/I、Y181C/I，这与国内及河南省前期报道结果一致^{[3, 16]}，这些突变一旦出现会导致对依非韦仑和奈韦拉平的高度耐药。由于非核苷类药物之间易出现交叉耐药，还会造成其他非核苷类药物的高度耐药 ^[17-18]。因此，本结果中不仅依非韦仑和奈韦拉平以高度耐药为主，还有新一代非核苷类药物利匹韦林和多拉韦林出现相当比例的中、高度耐药，极大地限制了新药的使用。

PIs和INSTIs突变发生较少。PIs突变率位居前3位的主要突变分别是M46I、V82A/F和I54V/MV。由于PIs的耐药屏障较高，产生耐药一般需要多个主要突变同时发生，在本研究中仅发现13例患者因M46I、V82A和I54V同时发生突变，造成洛匹那韦/利托那韦高度耐药。但由于河南省使用洛匹那韦/利托那韦患者较多^[1]，仍要警惕PIs耐药问题。在INSTIs中，以次要突变E157Q/EQ的突变率最高，主要突变Q148R/OH、N155H、R263K突变率低。在一代INSTIs中，拉替拉韦、艾维雷韦耐药屏障相对较低，1个主要突变Q148H/R或N155H/S可引起拉替拉韦高度耐药，且拉替拉韦和艾维雷韦存在交叉耐药^[19]；在二代INSTIs中，多替拉韦和比克替拉韦耐药至少需要≥2个主要突变，耐药屏障较高。虽然INSTIs在临床上应用时间较短，但本研究发现，有6例艾滋病患者对所有INSTIs全部耐药，造成后续方案选择困难。随着INSTIs进入医疗保险报销政策，艾滋病患者更多选择使用，临床上根据患者耐药结果合理规范使用，加强依从性教育，避免或减少INSTIs耐药的发生。

综上所述，河南省艾滋病患者ART失败的耐药率高，主要表现在NNRTIs和NRTIs耐药率高，耐药突变复杂多样。虽然目前INSTIs和PIs耐药相对较少，但耐药风险仍需警惕。建议有条件的情况下，对ART前的患者开展耐药检测，选择高耐药屏障药物治疗，在ART之后要及时进行病毒载量检测，评估疗效，一旦发现ART失败，尽快进行耐药检测和更换ART方案。对病毒载量50~1 000拷贝数/ml之间的患者开展耐药检测，也是及早发现耐药、应对HIV-1耐药的举措之一。

利益冲突  所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明  杨萱：研究设计、论文撰写、数据分析；孙燕：研究指导、论文修改；霍玉奇、刘金瑾：实验操作，英文校对；张晓华、张雪：数据收集整理；赵淑娴、王艳：标本采集；赵清霞：研究指导、审阅文章；陈昭云：数据收集整理、统计分析