文章信息
- 宋丽, 丁玲, 冯美娟, 李小雪, 高雯, 祁卓, 刘虹, 王铭, 王金桃.
- Song Li, Ding Ling, Feng Meijuan, Li Xiaoxue, Gao Wen, Qi Zhuo, Liu Hong, Wang Ming, Wang Jintao
- hnRNP E1对HPV16早期基因E2、E6的调控及其对宫颈癌细胞生物学功能的影响
- Effects of hnRNP E1 on expression of early genes E2, E6 of HPV16 and biological function in cervical cancer cells
- 中华流行病学杂志, 2021, 42(2): 321-326
- Chinese Journal of Epidemiology, 2021, 42(2): 321-326
- http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.cn112338-20191009-00723
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文章历史
收稿日期: 2019-10-09
核内不均一性核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoproteins,hnRNPs)是人细胞内特有的一类RNA结合蛋白,已被发现20余种[1]。hnRNP E1作为hnRNPs家族中的重要成员,含有3个高度保守的K同源域(K homology,KH),通过其与RNA结合或者特异性与多种基因启动子序列相互作用,参与基因的可变剪接,以及基因转录调节、翻译调控、信号转导、细胞代谢等一系列生物学转化过程[2]。研究显示,hnRNP E1与胃癌、肺癌、甲状腺癌、宫颈癌等多种肿瘤的发生密切相关[3]。高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)感染是宫颈癌发生最主要的病因,其中HPV16感染与宫颈癌的发生最为密切[4],而HPV16 E2和E6基因在癌症的发生发展过程中起着重要作用[5-6]。值得关注的是,HPV16基因中含有多个与hnRNP E1特异结合的位点,而hnRNP E1具有的KH域提供了与HPV16基因发生特异性结合的独特分子结构,据此我们推测hnRNP E1可能对HPV16早期基因E2、E6的表达具有调控作用,进而影响宫颈癌细胞的生物学功能。为此,本研究在课题组前期研究基础上[7],采用体外实验方法,深入探讨上调hnRNP E1对HPV16 E2、E6的调控作用及宫颈癌细胞生物学功能的影响,以期为宫颈癌变病因及机制研究提供一定的理论依据。
材料与方法1. 细胞来源及培养:HPV16阳性宫颈鳞癌SiHa细胞株购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心,在本实验室保存。用含10%胎牛血清和1%青、链霉素的DMEM高糖培养基,置于37 ℃、5%CO2、95%湿度培养箱中常规培养。
2. hnRNP E1质粒转染及分组:调整细胞密度为2×105个/ml,以每孔1 ml接种至24孔板,常规培养细胞汇合度达到75%左右时进行转染。根据转染试剂(X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent,德国Roche公司)说明书配制转染复合剂,转染试剂(μl)与含绿色荧光蛋白(GFP)报告基因的质粒DNA(μg)按不同比例(1∶1、2∶1、3∶1、4∶1)进行转染,计算转染后不同时间(6、12、24、48、72 h)转染效率,筛选出转染试剂与质粒最佳转染比例和时间。采用含有hnRNP E1 cDNA的过表达质粒(CMV-MCS-IRES-EGFP-SV40-Neomycin,上海吉凯基因化学技术有限公司)上调hnRNP E1,形成空白组(仅用转染试剂处理)、空质粒组(空质粒转染)、hnRNP E1过表达组(hnRNP E1过表达质粒转染)进行后续实验。每组均设3个复孔,所有实验重复3次。
3. 实验方法:
(1)Real-time PCR法检测目的基因mRNA表达水平:hnRNP E1、HPV16 E2、E6和β-actin的基因特异引物序列及扩增片段长度见表 1。常规消化、收集各组细胞,按照TransZol说明书(中国北京全式金生物技术有限公司)提取细胞总RNA。按照TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(中国北京全式金生物技术有限公司)和QuantiFast SYBR Green RT-PCR(德国Qiagen公司)说明书进行反转录、扩增。扩增程序:95 ℃ 5 min;95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,40个循环;熔解曲线程序:95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,95 ℃ 15 s。以2-ΔΔct值反映实验组目的基因mRNA的表达相对于对照组的变化倍数。
(2)Western blot法检测细胞中hnRNP E1和HPV16 E2、E6蛋白表达水平:常规消化、收集细胞,加入含PMSF的RIPA裂解液(100 μl/106个细胞),冰上裂解25 min,4 ℃、15 294 g离心15 min,收集上清。采用二喹啉甲酸法进行蛋白定量,参照课题组前期建立的方法[8]检测hnRNP E1、HPV16 E2和E6蛋白表达水平。一抗分别为兔抗人hnRNP E1蛋白(1∶1 000,英国Abcam公司)、兔抗人HPV16 E2蛋白(1∶100,英国Abcam公司)、鼠抗人HPV16 E6蛋白(1∶500,英国Abcam公司),设内参对照为鼠抗人β-actin抗体(1∶300,英国Abcam公司),分别在43、42、18、43 kDa处获得hnRNP E1、HPV16 E2、HPV16 E6和β-actin特异性抗体结合蛋白条带。利用Image Lab软件分析条带灰度值,以目的条带与内参β-actin条带灰度值的比值作为hnRNP E1、HPV16 E2、E6蛋白的相对表达量。
(3)CCK-8法检测细胞增殖:于96孔板接种SiHa细胞(3×103个/100 μl),常规培养24 h后进行转染,在转染0、12、24、48、72 h后,加入10 μl CCK-8试剂,继续培养2 h,测定450 nm处的A值。
(4)流式细胞术检测细胞周期和凋亡:细胞周期分布:3组细胞培养48 h,将细胞样品提取、离心,调整细胞密度为2×105个/ml。取1 ml单细胞悬液,离心后弃上清,在细胞中加入500 μl 70% 乙醇,4 ℃固定12 h,离心去乙醇并用PBS漂洗,加100 μl RNaseA于37 ℃水浴30 min,再加入400 μl碘化丙啶染色混匀,4 ℃避光30 min,1 h内于流式细胞仪完成检测。细胞凋亡检测:转染48 h后收集3组细胞,调整细胞密度为2×105个/ml,将收集后的细胞以106 g离心5 min,弃上清,加500 μl Binding Buffer重悬细胞,加Annexin V-APC和碘化丙啶各5 μl混匀,室温避光15 min,1 h内于流式细胞仪检测细胞凋亡率。
4. 统计学分析:利用SPSS 22.0和Graphpad Prism 7.0软件分别完成统计分析和作图。符合正态分布的计量资料采用x±s描述,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用Bonferroni法,不符合正态分布的定量资料采用M(QR)进行描述,多组间比较采用非参数检验,组间两两比较采用Wilcoxon秩和检验。检验水准α=0.05。
结果1. hnRNP E1转染条件优化及效果评价:转染试剂与质粒DNA比例在3∶1、转染48 h时,转染效率最高,平均可达70%(图 1),故以此作为后续实验的转染条件。由图 2可见,过表达组hnRNP E1 mRNA表达量显著高于空白组和空质粒组,空白组与空质粒组mRNA相对表达量差异无统计学意义(P=0.513)。Western blot结果显示,hnRNP E1过表达组蛋白表达水平是空白组与空质粒组的近4倍,空白组和空质粒组蛋白表达水平差异无统计学意义(P=0.827)。表明hnRNP E1 cDNA转染成功。
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注:转染试剂与质粒比例:Ⓐ:1∶1;Ⓑ:2∶1;Ⓒ:3∶1;Ⓓ:4∶1(左:荧光光源;右:普通光源) 图 1 空质粒转染SiHa细胞48 h时效果(×200) |
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图 2 转染前后hnRNP E1相对表达水平 |
2. hnRNP E1对HPV16 E6基因表达的抑制作用:HPV16 E6基因的mRNA表达量在空白组、空质粒组和过表达组差异有统计学意义(F=19.062,P=0.003),hnRNP E1过表达组HPV16 E6 mRNA水平低于空白组与空质粒组,差异有统计学意义(P < 0.05);3组HPV16 E2 mRNA表达量差异无统计学意义(H=1.703,P=0.427)。见图 3。HPV16 E6蛋白表达水平在空白组、空质粒组和过表达组差异有统计学意义(F=9.595,P=0.014),hnRNP E1过表达组HPV16 E6蛋白表达水平显著低于空白组和空质粒组,差异有统计学意义(均P < 0.05),但HPV16 E2蛋白在3组中均未检测到,见图 3。
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图 3 hnRNP E1过表达对HPV16 E2、E6 mRNA和蛋白表达水平的影响 |
3. hnRNP E1过表达对SiHa细胞生物学功能的影响:在24、48、72 h时,hnRNP E1过表达组细胞活性低于空白组和空质粒组,差异有统计学意义(P < 0.05),空白组和空质粒组在不同时点细胞活性差异无统计学意义(P > 0.05),hnRNP E1对SiHa细胞的生长表现为抑制作用。见图 4。
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注:a P < 0.05 图 4 hnRNP E1过表达对SiHa细胞增殖的影响 |
空白组、空质粒组和过表达组间处于G0/G1期和G2/M期的细胞数目及增殖指数(PI)总体差异有统计学意义(均P < 0.05),与空白组和空质粒组相比,过表达组G0/G1期的细胞比例显著升高,而S、G2/M期细胞比例及PI下降。空白组和空质粒组各周期细胞比例相比,差异无统计学意义(均P > 0.05)。见图 5。
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注:a P < 0.01 图 5 hnRNP E1过表达对SiHa细胞周期的影响 |
hnRNP E1表达上调后,细胞晚期凋亡率和总凋亡率均高于空白组和空质粒组,差异有统计学意义(均P < 0.05),而空白组和空质粒组间早、晚期凋亡率及总凋亡率差异无统计学意义(均P > 0.05)。见图 6。
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注:a P < 0.01 图 6 hnRNP E1过表达对SiHa细胞凋亡的影响 |
4. HPV16 E6基因与SiHa细胞生物学功能的关系:基于前述上调hnRNP E1对HPV16 E6基因的表达及细胞生物学功能均有影响的基础上,进一步分析了hnRNP E1上调前后HPV16 E6基因表达与细胞增殖和凋亡的关系。结果显示,从hnRNP E1空白组、空质粒组到过表达组,随着HPV16 E6 mRNA和蛋白表达水平的降低,SiHa细胞PI下降(P < 0.01),而总凋亡率逐渐增加(P < 0.01),尤其在hnRNP E1过表达组,它们之间的关联性更为明显(P < 0.01)。见图 7。
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注:a与空白组和空质粒组相比,P < 0.01 图 7 HPV16 E6基因表达与SiHa细胞增殖和凋亡的关系 |
宫颈癌是全球女性第四大常见肿瘤,病死率居女性肿瘤之首[9]。高危型HPV持续感染是导致宫颈癌的主要病因。HPV E6、E7是主要的癌基因,不仅可直接转化细胞,还可干扰正常的细胞周期调控,引起癌变,特别是E6基因与癌变发生的关系更为紧密。E6可与许多蛋白相互作用并使相应蛋白失活,而这些蛋白在调节细胞凋亡、肿瘤抑制基因转录和控制细胞增殖方面发挥关键作用。E2蛋白可调节病毒mRNA转录及DNA复制,对E6、E7基因的转录进行调控[10-14]。
然而,越来越多的研究提示HPV致癌过程中,其基因的表达可能受到诸多因素的调节。hnRNP E1广泛分布于人体组织和细胞,其特有的KH结构域具有多聚胞嘧啶结合特性,可通过与RNA结合或者特异性与多种基因启动子序列相互作用,调控mRNA的稳定性及表达,受调控的基因涉及免疫应答、上皮细胞恶性转化、肿瘤形成与进展等多个过程[1]。hnRNP E1与调控细胞周期的原癌基因c-myc的IRES区域结合以调控c-myc的转录水平,从而可能影响细胞周期进程[15]。Wang等[16]发现hnRNP E1通过下调PRL-3的翻译抑制肿瘤的形成。Zhang等[17]研究发现,在营养缺乏条件下,hnRNP E1过表达可抑制人结直肠癌细胞和卵巢癌细胞增殖,促进凋亡。已有研究显示,hnRNP E1低表达可增加宫颈癌发病风险[18-19]。本结果表明,上调hnRNP E1可抑制宫颈癌细胞增殖及细胞周期向G2/M期转变,促进细胞凋亡,提示hnRNP E1对宫颈癌变的发生具有抑制作用,可作为宫颈病变生物治疗的潜在靶点。
Collier等[20]研究发现hnRNP E1对HPV16晚期基因L2 mRNA的翻译具有抑制作用,但hnRNP E1对HPV16早期基因是否具有调控作用国内外鲜见报道。本研究结果显示,上调hnRNP E1可降低HPV16 E6 mRNA和蛋白表达水平。E6是病毒感染后最早表达的基因之一,含有hnRNP E1选择性结合位点[10]。hnRNP E1结构中存在的KH结构域可能通过与HPV16 E6基因调控元件结合,降低HPV16 E6蛋白的表达[21]。本研究结果显示,随着HPV16 E6 mRNA和蛋白表达水平的降低,SiHa细胞增殖指数下降,总凋亡率增加,而值得关注的是,上调hnRNP E1后,这种效应更为显著。提示HPV16 E6的低表达可抑制宫颈癌细胞增殖,促进其凋亡,而这种效应可能受到hnRNP E1的调控。上调hnRNP E1,特别是结合HPV16感染的控制模式,可能为宫颈癌的防治开拓新思路。研究显示,HPV16 E2可编码调节病毒DNA转录的蛋白质,在细胞转化、启动和抑制凋亡、转录调控以及调控HPV的永生化转化潜能等方面发挥重要作用[22]。本研究中未发现hnRNP E1与HPV16 E2在SiHa细胞中的关系,可能与SiHa细胞中HPV16主要以整合形式存在,而整合时HPV16 E2 DNA缺失,进而导致蛋白不表达有关。当然,本研究结果尚不能提供hnRNP E1在宫颈癌进展中调控HPV16基因、影响细胞增殖和凋亡的直接证据,其详细机制尚需深入研究。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
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