从免疫学角度看，妊娠是一种特殊的免疫耐受状态，正常妊娠时Thl型细胞因子表达缺乏，Th2型细胞因子呈优势表达，白介素18(IL-18)是具有多种免疫调节功能的细胞因子，参与宿主抗胞内感染、肿瘤免疫，能够促进Th1细胞增殖和Th1型免疫应答，Thl型免疫反应能增强宿主抵抗微生物的感染，从而有利于HBV的清除^[1]。在HBV感染中，垂直传播无法完全阻断而成为研究热点^[2]，IL-18在整个妊娠过程中发挥重要作用，因此研究IL-18在HBV宫内传播(BIT)中的作用有重要意义。本研究通过监测HBsAg阳性产妇外周血IL-18水平，探讨HBsAg阳性产妇外周血IL-18水平在BIT中的表达变化。

1.研究对象：收集2015年1月至2017年5月陕西省西北妇女儿童医院住院产妇282例，其新生儿285例。纳入标准：①HBsAg为阳性产妇；②所生新生儿在出生24 h内未接种乙型肝炎(乙肝)疫苗和卡介苗前采集静脉血；③新生儿身体状况符合抽血条件；④知情同意。

2.研究方法：采用病例对照研究，比较病例组HBsAg阳性与对照组HBsAg阴性产妇IL-18水平的差别。HBsAg阳性产妇在孕期接受的干预措施包括：抗病毒治疗、接种乙肝疫苗和注射乙肝免疫球蛋白(HBIG)情况。

(1) 分组：采用两组均数比较的样本量估计方法。根据预实验数据设定相关参数：病例组(95.66±85.62)，对照组(51.51±46.58)。等比例分组，采用PASS 16.0软件计算病例组与对照组样本量各为40例。同期选择45例健康产妇为对照组，纳入标准：①产妇血清HBsAg及HBV DNA均为阴性；②年龄匹配；③居住地匹配；④新生儿身体状况符合抽血条件。排除标准：①罹患其他感染性疾病；②未签署知情同意书。

(2) 问卷调查：产妇的一般情况、家族史、本次妊娠史以及生产情况和新生儿情况等。

(3) 标本采集：采集产妇临产前肘静脉血及其新生儿(出生24 h内)股静脉血。均1 500 r/min、6 min分离血清，-20 ℃保存备用。

(4) 血清HBV标志物检测：产妇及新生儿HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe和抗-HBc(乙肝五项)均采用ELISA法检测，操作和结果判定按试剂盒说明书(北京万泰生物药业股份有限公司)进行。HBV DNA载量采用PCR-荧光探针法检测，操作和结果判定按照试剂盒说明书(湖南圣湘生物科技有限公司)进行。

(5) 产妇外周血IL-18检测：采用流式液相芯片法检测，7-PLEX HUMAN CYTOKINE PANEL 96 well plate Assay (SPR1036)试剂盒(美国MILLIPLEX公司)。各种检测均严格按照试剂盒说明书进行操作和判读结果。采用流式检测仪Luminex^®200^TM (美国伯乐公司)检测。

(6) 新生儿HBV感染结果判定：① BIT：HBV宫内显性感染(DBI)与HBV宫内隐匿性感染(OBI)的统称^[2]，即HBsAg阳性产妇所生新生儿24 h静脉血中HBsAg阳性或HBV DNA载量≥200拷贝/ml；②DBI：HBsAg阳性产妇所生新生儿24 h静脉血中HBsAg阳性者；③OBI：HBsAg阳性产妇所生新生儿24 h静脉血中HBsAg阴性，但HBV DNA载量≥200拷贝/ml，或者新生儿在全程接种HBIG和3针乙肝疫苗后外周静脉血中HBsAg阴性，但HBV DNA载量≥200拷贝/ml。④HBV宫内未传播(NBIT)：新生儿外周血检测HBsAg和HBV DNA均为阴性。

(7) 相关定义：①孕早期出血：孕1~13周，出现的阴道出血，血液多呈咖啡色或鲜红色；②孕晚期出血：孕28周后的阴道出血；③抗病毒治疗：为了降低HBsAg阳性孕妇发生婴儿感染风险，临床上对HBV DNA载量＞2×10⁶拷贝/ml或具有HBsAg阳性家族史或既往子代感染HBV指征的孕妇建议抗病毒治疗，建议在怀孕24~28周开始口服替诺福韦或替比夫定，并于分娩前检测HBV DNA；④乙肝疫苗接种：全程需接种3针，免疫程序为0-1-6个月，即接种第1针疫苗后，间隔1、6个月分别接种第2、3针疫苗，每针疫苗接种20 μg；⑤ HBIG注射：目前仍在一些医院允许在孕期使用HBIG用于预防HBV宫内感染，一般用于孕晚期，于孕28、32及36周肌肉注射HBIG 200 IU或每月1次(200 IU/次)，使用3~5次；具体剂量依据检测HBeAg状态、孕妇主观要求而定。

3.质量控制：调查员和实验员进行统一培训，调查表采用双人双录入核对，随机抽取10%重复测量。通过Kappa系数法一致性检验分析，Kappa值为0.99，结果表明，本次调查信度较好。实验检测均设有阴阳性、空白对照，并随机抽取30%进行复测，通过Kappa系数法一致性检验分析，乙肝五项ELISA检测结果Kappa值为0.98；HBV DNA载量检测结果Kappa值为0.94，IL-18检测结果Kappa值为0.87，结果表明本研究检测结果可信度较好。

4.统计学分析：采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。计量资料方差齐者采用t检验，方差不齐者采用t检验，计数资料采用χ²检验。相关影响因素采用多元线性回归分析，以估计相关因素与IL-18的关联强度。把握度(1－β)＝0.08，检验水准α＝0.05，双侧检验。

1.社会人口学特征和BIT情况：HBsAg阳性产妇282例及新生儿285例，产妇年龄20~45(29±3.49)岁，HBsAg及HBV DNA均为阴性的正常产妇43例，年龄(28±5.00)岁。两组社会人口学特征均衡可比(P＞0.05)(表 1)。检测发现，285名新生儿外周血HBsAg为阳性者24例，HBsAg阴性的261名新生儿中HBV DNA载量≥200拷贝/ml者114例，即该人群发生DBI、OBI和BIT率分别为8.42%(24/285)、40.00%(114/285)和48.42%(138/285)。

表 1 HBsAg阳性和阴性产妇及新生儿一般情况

表选项

2.不同HBV宫内传播分组产妇中外周血的IL-18水平比较：HBsAg阴性产妇IL-18水平显著低于HBsAg阳性产妇组(P＝0.001)、NBIT组(P＝0.001)、OBI组(P＝0.000)，差异有统计学意义；在HBsAg阳性产妇外周血中虽然DBI组IL-18水平最低，OBI组最高，但是3组间差异无统计学意义(表 2)。

表 2 HBsAg阴性产妇与HBsAg阳性产妇各宫内传播组IL-18水平情况

表选项

3.不同HBV感染特征下产妇外周血IL-18状况：HBsAg阳性产妇HBV感染特征包括HBeAg和HBV DNA载量，①HBeAg：HBeAg阴性组外周血的IL-18水平显著低于HBeAg阳性组(P＝0.023)，DBI组中HBeAg阴性组外周血的IL-18水平也显著低于HBeAg阳性组(P＝0.044)；②HBV DNA载量按10³和10⁶拷贝/ml为截点分组，当HBV DNA载量≥10³拷贝/ml后，其IL-18水平均显著高于HBsAg阴性产妇组(P＜0.01)，并随着母体血中HBV DNA载量的增高，其IL-18水平呈增高趋势(P＝0.024)，其中NBIT组也随HBV DNA载量增高呈增高趋势(P＝0.002)；当HBV DNA载量在10³~10⁶拷贝/ml时DBI组IL-18水平显著低于NBIT组(P＝0.022)，并随着母体血中HBV DNA载量的增高，其IL-18水平呈增高趋势(P＝0.016)(表 3)。

表 3 HBsAg阳性产妇不同HBV感染特征下各组的IL-18水平对比

表选项

4. HBsAg阳性产妇孕期干预情况与IL-18水平的关系：各因素干预组与未干预组间IL-18水平差异均无统计学意义(P＞0.05)，且DBI、OBI、NBIT组在各因素干预组与未干预组间IL-18水平差异均无统计学意义(P＞0.05)。未接种乙肝疫苗组中随着BIT程度的加重，产妇外周血IL-18含量呈明显减少趋势(P＝0.044)，未接种乙肝疫苗和HBIG组中OBI组IL-18水平均显著高于NBIT组(P＜0.05)(表 4)。

表 4 HBsAg阳性产妇不同干预因素下IL-18水平的对比

表选项

5.HBsAg阳性产妇各因素与IL-18水平的多因素分析：对母体的HBV感染血清学因素、妊娠过程中的暴露史以及新生儿出生时情况与IL-18进行相关分析，发现产妇IL-18水平与其年龄(P＝0.012)、HBeAg(P＝0.016)、HBeAb(P＝0.012)、乙肝疫苗接种(P＝0.005)、HBIG注射(P＝0.009)、孕早期出血(P＝0.001)、孕晚期出血(P＝0.007)和新生儿HBV DNA载量按10³、10⁶拷贝/ml为截点分组(P＝0.001)相关，多因素分析结果显示，排除了其他因素影响仅产妇HBeAg与母体IL-18水平的线性关系有统计学意义(P＝0.01)(表 3)。

妊娠晚期主要是以Th1细胞免疫为主，IL-18能促使Thl细胞、NK细胞增殖和发挥细胞毒活性，IL-18、IL-18受体(IL-18R)及IL-18结合蛋白(IL- 18BP)是目前研究CHB发病机制最受关注的细胞因子之一^[5]。本研究发现HBsAg阴性产妇外周血中IL-18水平显著低于HBsAg阳性产妇组、NBIT组、OBI组，符合既往研究提出当HBV攻击机体时，Th1细胞占优势可以促进细胞免疫，从而清除细胞内病毒^[6-7]的论点；同时，当HBV DNA载量≥10³拷贝/ml，其IL-18水平均显著高于对照组，并随着母体血中HBV DNA载量的增高，其IL-18水平呈增高趋势，其中NBIT组也呈现显著差异趋势；即提示HBsAg阳性产妇Th1细胞活跃性高于HBsAg阴性产妇，可能是由于体内病毒抗原激发机体免疫导致的IL-18升高，促使Th1细胞发挥细胞免疫应对HBV攻击，并且在病毒载量一定水平的前提下呈现正相关递增^[8]，这与本研究结果相符。

本研究还发现HBsAg阳性产妇外周血中IL-18呈现OBI组最高趋势，即OBI组的Th1细胞活性优于NBIT组，可能与母体病毒水平高低有关，导致其IL-18激发水平的差异；然而DBI组产妇其IL-18水平低于NBIT组和OBI组，当HBV DNA载量在10³~10⁶拷贝/ml时，DBI组的IL-18水平显著低于NBIT组，并随着BIT的加重，其IL-18水平呈下降趋势，呈现Th2细胞优势。既往研究也提出无症状携带者Th1功能减退，呈病毒高复制状态，Th2应答占优势^[6-7]，有研究表明IL-18能上调Th1细胞免疫反应同时抑制Th2细胞反应影响Th1/Th2细胞平衡，提出HBV携带者孕妇外周血IL-18低水平参与HBV宫内感染机制^[8]。本研究的DBI等于传统研究中的宫内感染组，因此，本研究与既往研究结果一致，即HBsAg阳性产妇外周血IL-18水平降低，其新生儿发生DBI可能性升高。

在机体对HBV的免疫应答过程中，HBeAg与HBcAg结构上的差异以及受宿主MHC和T细胞识别部位的不同，HBeAg可以诱导Th1细胞耐受，诱导特异性的Th2细胞增殖，并促进Th2细胞因子大量分泌，从而下调机体对HBcAg的免疫攻击反应^[9-11]。本研究发现HBeAg阴性组IL-18水平显著低于HBeAg阳性组，DBI组中HBeAg阴性组IL-18水平也显著低于HBeAg阳性组，即HBeAg阳性和BIT者，其体内HBV病原体较容易刺激母体的免疫应答，试图保护胎儿免受HBV感染，而母体的HBeAg若传播至胎儿并通过Th1/Th2细胞亚群失衡引起胎儿机体对HBV耐受，将会导致HBV宫内感染发生^[8]，因此，既往研究结论从某种程度上支持本研究结果。

从本研究HBsAg阳性产妇孕期干预情况来看，进行抗病毒治疗、接种乙肝疫苗和注射HBIG的孕妇存在自我选择性，往往是HBV DNA载量＞10⁶拷贝/ml和HBeAg阳性者更倾向于选择阻断干预，如：71.42%的HBeAg阳性者选择注射HBIG，而仅21.22%的HBeAg阴性者选择注射HBIG，18.82%的HBeAg阳性者选择抗病毒治疗，10.85%的HBeAg阴性者选择抗病毒治疗等现象；导致检测其外周血IL-18水平存在HBV感染本底因素的混杂，本研究发现除接种乙肝疫苗组外，其他组别均呈现IL-18水平显著高于对照组，未接种乙肝疫苗组中呈现随着BIT程度的加重，产妇外周血IL-18含量明显减少的趋势，未接种乙肝疫苗和未注射HBIG组中OBI组IL-18水平均显著高于NBIT组，推测HBIG能明显激发机体IL-18升高，而高水平的IL-18更有利于阻断BIT，有研究提出注射一定剂量的IL-18能快速、可逆性地抑制HBV复制，且无明显的细胞毒性作用，提出IL-18可能是一种潜在的治疗慢性乙肝药物^[10-11]，因此，较高水平的IL-18有利于孕妇清除体内HBV，甚至推测可以免疫阻断和治疗HBV宫内感染中的细胞因子产生异常及水平低下者，对降低BIT概率有积极意义。

通过多因素分析发现孕妇体内IL-18水平与其HBV感染状态密切相关，尤其HBeAg与IL-18存在着一定的内在联系。因此控制BIT的首要任务是减少孕妇体内病毒负荷量、改善感染状况；同时，母体孕期IL-18水平与新生儿BIT结局也密切相关。既往对BIT只针对新生儿发生HBsAg阳性者，忽略了基数更大的OBI者，本研究针对IL-18的研究首次拓展了BIT定义范畴，一旦发生BIT，便极可能会产生免疫耐受，导致胎儿及新生儿不能及时有效地清除体内病毒，故预防及降低胎儿BIT的发生，重点应放在孕妇管理的环节。

综上所述，IL-18是Th1/Th2网络平衡更高层次的调控者，监测HBsAg阳性孕妇体内IL-18水平，不仅可以对其新生儿发生DBI和OBI进行预判，而且可以考虑作为干预手段，尤其对于HBeAg阳性和HBV DNA载量≥10³拷贝/ml者，提高母体的细胞免疫功能，有利于控制BIT。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突