HBV母婴传播是导致众多HBV慢性携带者及相关疾病的重要原因，而HBV宫内传播是母婴传播的重要成因。HBeAg阳性母亲的新生儿经乙型肝炎（乙肝）疫苗和乙肝高效价免疫球蛋白（HBIG）免疫后，仍有5%~15%发生HBV宫内传播^[1-4]，但机制不明。有研究表明，在HBeAg阳性慢性乙肝患者外周血及HBeAg阳性新生儿脐血中^[5-6]，调节性T淋巴细胞（Treg）含量均高于HBeAg阴性者，但并未发现两者间相关性及其与宫内传播的关系。血清中HBeAg可作为免疫调节蛋白，引起T淋巴细胞耐受，导致病毒持续感染^[7]，而Treg能抑制HBV特异性免疫应答^{[5, 8]}，因此HBeAg阳性母亲新生儿HBV宫内传播风险增加是否与母亲HBeAg通过胎盘进入胎儿体内影响新生儿Treg含量有关^[9]。为此本研究通过探讨HBsAg阳性母亲的HBeAg与新生儿相关免疫细胞的表达情况，以进一步探讨HBV宫内传播的机制。

1.研究对象：为2011年7月至2013年1月在太原市第三人民医院产科收集的270对HBsAg阳性母亲及其新生儿。纳入标准为孕期未服用替比夫定等抗病毒及皮质激素类药物，且未合并梅毒、丙肝等感染；新生儿足月产（孕周＞37周）且体重正常（2 500~4 000 g）。母亲分娩时进行问卷调查，并采集母亲分娩前肘静脉血及新生儿出生24 h内主、被动免疫前股静脉血各3 ml。本研究经山西医科大学伦理委员会批准，所有研究对象均签署知情同意书。

2.研究方法：

（1）血清HBV标志物及HBV DNA载量检测：采用化学发光免疫试验（CLIA）检测母亲及新生儿HBV血清学标志物（HBsAg、HBeAg）（试剂购自德国罗氏诊断有限公司），HBsAg≥1.00 COI，HBeAg≥1.00 COI判定为阳性。采用PE5700基因扩增仪行荧光定量聚合酶链式反应（FQ-PCR），检测母亲及新生儿血清中HBV DNA载量（试剂购自中山大学达安基因股份有限公司）。HBV DNA载量≤10³拷贝/ml判定为阴性，HBV DNA载量＞10³拷贝/ml判定为阳性。

（2）新生儿Treg及树突状细胞（DC）的检测：采用FACS Calibur流式细胞仪（美国BD公司），鼠抗人CD4-FITC、CD₂₅-PE、Foxp₃-PE-Cy5、CDllc-PE、CD_l23-PE、Human Hematopoietie Lineage-FITC Cocktail、HLA-DR-PerCP-Cy5.5及同型对照（美国eBioscience公司）等试剂，检测新生儿股静脉血中免疫细胞的含量^[10-11]。用CELLQUEST软件分析Treg占CD₄⁺T淋巴细胞比例，DC数量以各亚群占外周血单个核细胞（PBMC）的比例表示。

3. HBV宫内传播判定标准：新生儿出生24 h内，主、被动免疫前，股静脉血HBsAg阳性和/或HBV DNA＞1×10³拷贝/ml者判定为HBV宫内传播^[3]。

4.统计学分析：采用SAS 9.4软件进行数据分析。描述服从正态分布的资料采用x±s，偏态分布资料采用M值和四分位数间距（Q_R）；定量资料组间比较采用秩和检验（两两比较采用Nemenyi法）；定性资料组间比较采用χ²检验；相关性分析采用Spearman秩相关；多因素分析采用非条件logistic回归，P＜0.05表示差异有统计学意义。

1.一般情况：共纳入HBsAg阳性母亲及其足月新生儿270对，其中母亲HBeAg阳性112例，阴性158例。母亲年龄及孕周分别为（27.53±4.37）岁和（39.19±0.96）周，新生儿男女性别比例、体重及身长分别为1.14 : 1、（3 296.48±334.64）g、（49.83±1.11）cm。HBsAg阳性母亲HBV宫内传播率为13.33%（36/270），HBsAg和HBeAg同时阳性的母亲导致HBV宫内传播占全部宫内传播的63.89%（23/36），发生HBV宫内传播的新生儿中，13.89%（5/36）为HBsAg和HBV DNA同时阳性。

2. HBeAg与HBV宫内传播的关系：非条件logistic回归模型进行多因素分析（采用逐步回归法，以α＝0.05为入选水准，α＝0.10为剔除水准）显示，调整混杂因素（母亲HBV DNA、母亲年龄、分娩方式、孕产史、孕期是否注射HBIG）后，母亲HBeAg阳性的新生儿发生HBV宫内传播的风险相比阴性者的新生儿增加了3.08倍[OR＝4.08（95%CI：1.89~8.82），P＜0.001]，是新生儿HBV宫内传播的危险因素。

3.母亲HBeAg血清学状态及滴度与新生儿Treg含量的关系：将母亲HBeAg阳性者按照HBeAg滴度的四分位数P₂₅、P₅₀、P₇₅（833.1 COI、1 054 COI、1 273 COI）分为4组，加之HBeAg阴性组，共5组。比较5组的一般情况（孕周、分娩方式、孕产史、宫内窘迫发生率及新生儿体重）差异均无统计学意义（P＞0.05）（表 1）。经分析，母亲HBeAg阳性者新生儿的Treg含量高于阴性者（Z＝2.29，P＝0.022）。5组新生儿Treg含量的差异有统计学意义（χ²＝18.73，P＜0.001）（表 2），进一步两两比较结果显示，HBeAg第3组（1 054 COI≤HBeAg＜1 273 COI）的Treg含量最高，与其他组比较差异有统计学意义，其余各组间差异无统计学意义（图 1）。

表 1 母亲HBeAg阴/阳性及不同滴度组一般情况比较

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表 2 母亲HBeAg阴/阳性及不同滴度与新生儿Treg的关系

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图 1 母亲HBeAg不同滴度组间新生儿Treg含量、母亲HBV DNA载量和新生儿HBeAg滴度的比较

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4.母亲HBeAg滴度与新生儿Treg含量的相关性分析：母亲HBeAg与HBV DNA及新生儿HBeAg均有较强的相关性（r_s＝0.73，P＜0.001；r_s＝0.78，P＜0.001），母亲HBeAg不同滴度组间的HBV DNA及新生儿HBeAg的差异有统计学意义（χ²＝183.09，P＜0.001；χ²＝181.60，P＜0.001）；两两比较，母亲HBeAg阳性各组HBV DNA载量及新生儿HBeAg含量均高于阴性组（图 1），与各组间Treg含量有相似的变化趋势。采用偏相关分析，控制母亲的HBV DNA载量与新生儿HBeAg后，新生儿Treg与母亲HBeAg滴度呈正相关，r_s＝0.19，P＝0.039。说明新生儿Treg含量随母亲HBeAg滴度的升高呈上升趋势。

5.新生儿Treg含量与相关免疫细胞含量的相关性分析：在抗病毒细胞免疫过程中，DC作为抗原提呈细胞与T淋巴细胞具有相辅相成的作用，采用偏相关分析，控制新生儿的mDC与CD₄⁺/CD₈⁺后，Treg含量与浆细胞样树突状细胞（pDC)呈负相关（r_s＝-0.21，P＝0.02）；控制CD₈⁺、mDC及pDC后，Treg与CD₄⁺呈负相关（r_s＝-0.32，P＝0.01），说明新生儿Treg的升高可能抑制pDC与CD₄⁺的增殖。但新生儿Treg含量与mDC、CD₈⁺、CD₄⁺/CD₈⁺之间无相关性（表 3）。

表 3 新生儿Treg与免疫细胞的相关性

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目前HBV宫内传播尚不能通过母婴阻断措施预防其引起的慢性感染。大多数研究一致认为，母亲HBeAg阳性是宫内传播的危险因素。

本文结果显示，112例HBeAg阳性母亲的新生儿有101例为HBeAg阳性，158例HBeAg阴性母亲的新生儿仅有1例为HBeAg阳性，HBeAg的胎盘通过率为90.18%（101/112），而且母亲与新生儿HBeAg滴度有较强的相关性（r_s＝0.78，P＜0.001）。而Wang和Zhu^[9]的研究认为，HBeAg为可溶性小分子物质，母体的HBeAg可通过胎盘传给胎儿。本文研究结果与其一致。

有研究表明^[7]，HBeAg作为一种耐受抗原可通过调节Th细胞亚群的分化，降低宿主T淋巴细胞对病毒的反应，使HBV感染趋于慢性化。因此母亲HBeAg阳性可降低新生儿对HBV的免疫应答，导致慢性感染。CD₄⁺CD₂₅⁺调节性T淋巴细胞是重要的免疫抑制细胞，Foxp3是其发育和功能维持的主要调节基因^[12]，本文采用CD₄⁺CD₂₅⁺Foxp3⁺调节性T淋巴细胞表示Treg。Stoop等^[5]研究表明，HBeAg阳性的慢性乙肝患者外周血中Treg含量明显高于HBeAg阴性者；许晓梅等^[6]研究显示HBeAg阳性产妇的新生儿脐带血Treg百分比与HBeAg阴性产妇及健康对照组相比明显增加，提示HBeAg可能通过上调新生儿Treg的数量介导免疫耐受，但其并未发现两者之间的相关关系。

本研究中母亲HBeAg阳性的新生儿其Treg含量大于阴性者。按母亲HBeAg滴度分组后，母亲HBeAg滴度水平第3组（1 054 COI≤HBeAg＜1 273 COI）新生儿Treg均高于其他组，也高于第4组（HBeAg≥1 273 COI）。进一步分析显示，第3组母亲HBV DNA载量及新生儿HBeAg含量也均高于第4组。高怡等^[11]研究显示，随产妇HBV DNA载量增加，新生儿外周血Treg含量增加；Peng等^[13]研究也认为，HBV DNA载量与CD₄⁺CD₂₅⁺调节性T淋巴细胞呈正相关。另外，张永臣等^[14]研究表明，HBeAg阳性新生儿股静脉血中Treg含量明显高于HBeAg阴性者。因此第3组新生儿Treg含量高于第4组可能是受其母亲HBV DNA载量及自身HBeAg滴度的影响。为避免母亲HBV DNA及新生儿HBeAg对母亲HBeAg与新生儿Treg含量关系的影响，在控制母亲的HBV DNA与新生儿的HBeAg后，母亲HBeAg滴度与新生儿Treg含量呈正相关。因此，我们初步认为，母亲的HBeAg可能会上调新生儿Treg的含量，且两者具有相关性，但相关强度并不高，还需扩大样本量深入研究。

本文结果还显示，新生儿Treg与pDC、CD₄⁺之间存在负相关。DC是能够激活初始T淋巴细胞并诱导特异性免疫应答的一类抗原提呈细胞，是机体适应性免疫应答的始动者，分为mDC和pDC两个亚群。Treg可能是通过分泌白细胞介素（IL）-10和转化生长因子（TGF）-β等抑制pDC活化^[15]，而pDC是机体内产生干扰素（IFN）-α的主要细胞^[16]，且后者对CD₄⁺和CD₈⁺的激活至关重要。因此Treg可能是通过抑制pDC产生IFN-α从而减弱效应T淋巴细胞的作用，抑制机体的免疫反应，最终增加新生儿HBV宫内传播风险。

总之，HBsAg阳性母亲的HBeAg可能通过上调新生儿Treg的含量影响pDC的成熟和效应T淋巴细胞的活化，从而降低新生儿对HBV的免疫应答，因此HBeAg可能导致免疫耐受，使新生儿HBV宫内传播发生率增加。HBeAg高滴度孕妇在孕期应及时检测并服用抗病毒药物抑制病毒复制水平，从而降低宫内传播发生率，提高其新生儿免疫预防效果。