2017, Vol. 38
文章信息
- 袁冬妹, 吴思英, 黄素丽, 蒋伟超, 柯跃斌.
- Yuan Dongmei, Wu Siying, Huang Suli, Jiang Weichao, Ke Yuebin.
- 血浆miRNA表达与儿童急性淋巴细胞白血病风险的关联研究
- Association between expression of plasma miRNA and the risk of childhood acute lymphocytic leukemia
- 中华流行病学杂志, 2017, 38(9): 1252-1258
- Chinese journal of Epidemiology, 2017, 38(9): 1252-1258
- http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0254-6450.2017.09.022
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文章历史
收稿日期: 2016-12-26
2. 350108 福州, 福建医科大学公共卫生学院流行病与卫生统计学系;
3. 350108 福州, 福建医科大学环境因素与肿瘤福建省重点实验室
2. Department of Epidemiology and Health Statistics, School of Public Health, Fujian Medical University, Fuzhou 350108, China;
3. Fujian Provincial Key Laboratory of Environment Factors and Cancer, Fujian Medical University, Fuzhou 350108, China
白血病死亡率位居儿童恶性肿瘤第1位[1]，其中78%为急性淋巴细胞白血病（ALL）[2]。14岁以下儿童ALL（cALL）占恶性肿瘤的23%~30%，而2~5岁为ALL发病高峰期[3]。有研究发现表观遗传学改变会使与细胞生长、凋亡和细胞周期调控等相关基因的表达发生变化，并最终参与白血病的发病进程[4]。MicroRNA（miRNA）是表观遗传修饰重要组成部分，为一种内源性含有19~22个核苷酸的非编码短链RNA，主要通过影响蛋白质翻译过程和mRNA的稳定性而发挥作用[5]。诸多研究表明，在一些类型癌症如肝癌[6]、白血病[5]中miRNA异常表达，可以作为癌症的生物标志物。本课题组通过LNATM miRNA表达谱芯片检测按相同性别和年龄（±1岁）1 : 1匹配的初发cALL和骨折患儿血浆miRNA的表达情况，筛选出一系列具有差异表达的miRNA，并选择部分miRNA进行实时定量PCR验证，旨在探讨miRNA与cALL发病风险及临床特征之间的关系，判断miRNA作为cALL的生物标志物的可行性，为评估miRNA成为cALL的诊断、治疗的生物标记物提供理论依据。
对象与方法1.研究对象：收集2015年1月至2016年11月在深圳市儿童医院确诊的初发cALL患儿和骨折患儿各111例，根据病例确诊年龄，分别按照性别相同和年龄（±1岁）1 : 1进行匹配，并从该人群中选择近期入院及血浆标本符合芯片送检标准的4对匹配的cALL和对照进行芯片检测。cALL（病例组）纳入标准：经细胞形态学、免疫学、遗传及分子生物学分型诊断[7]，其中细胞形态学分型：淋巴细胞型按FAB分型标准分为L1、L2、L3型；细胞遗传学改变：与ALL预后有利的核型有TEL-AML1融合基因、与ALL预后不利的核型有BCR-ABL1融合基因、MLL基因重排及其他等；临床危险度分型分为3型：低危、中危、高危；免疫表型分为T、B型。排除合并其他血液病或肿瘤以及HIV感染的＜14周岁疑似ALL患儿。对照组为因意外（伤害、坠落）导致外伤的＜14周岁的患儿，并排除HIV感染、先天异常、有肿瘤史及其他造血系统疾病（如营养不良性贫血和骨髓炎）或其他非意外伤。采用问卷调查获取儿童的基本信息以及环境化学物暴露等资料。入院后采集两组患儿首管EDTA抗凝血液，离心后分装200 μl血浆至Eppendorf管中，用于提取血浆总RNA。所有样本的采集均获得患儿家长或其监护人的知情同意，本研究获得深圳市CDC伦理委员会的批准。
2.血浆总RNA提取及检测：按AM1556试剂盒（美国Life Technologies公司）提取RNA。采用Taq Man MicroRNA Reverse Transcription Kit试剂盒的说明书操作（美国Life Technologies公司）进行miRNA反转录，各反应体系成分：100 mmol/ml dNTPs（0.05 μl）、反转录酶（50 U/μl）（0.33 μl）、10×反转录缓冲液（0.5 μl）、反转录酶抑制剂（20 U/μl，0.063 μl）、5×反转录引物（1 μl）、RNA（1 μl）、无RNA酶水（2.057 μl）。采用Taq Man MicroRNA Assays反应试剂盒（美国Life Technologies公司）进行实时定量PCR。在反转录反应产物中加入20 μl无RNA酶水稀释。PCR反应体系：2×Taq Man通用PCR反应液（5 μl），20×Taq Man miRNA探针（0.5 μl），反转录产物（4.5 μl）。以-ΔCt法计算miRNA的相对表达量，ΔCt＝CtmiRNA－Ctcel-miR-39，其中以cel-miR-39为内对照。
3. miRNA表达谱芯片技术：采用Exiqon公司LNATM miRNA表达谱芯片分析4对匹配病例组和对照组患儿血浆总RNA（交由康成生物工程有限公司完成）。采用miRCURYTM Array Power标记试剂盒获得荧光探针，在标准条件下使用MAUI杂交仪将标记好的探针和miRCURYTM芯片杂交。
4.统计学分析：采用EpiData 3.1软件录入数据，应用SPSS 17.0统计软件进行数据分析。正态分布的资料采用t检验，非正态的计量资料用秩和检验进行比较，定性资料采用χ2检验。将单因素分析差异有统计学意义的指标作为混杂因素进行调整，采用多因素条件logistic回归模型分析miRNA相对表达量与cALL发病风险的关联，利用受试者工作特征曲线（ROC）分析miRNA作为cALL分子标志物的曲线下面积（AUC），应用Medcalc软件比较不同模型的曲线下面积，采用重新分类方法分析miRNA的净重分类指数（net reclassification index，NRI）和综合判别指数（integrated discrimination improvement，IDI）。其中NRI值＞0为正向改善，＜0为负向改善，0则无改善[8]。IDI值则反映随新变量加入，模型对于预测区分结果事件和非结果事件风险概率的增加值[9]。用Pearson或Spearman相关分析miRNA表达水平与各变量的相关性。统计分析均采用双侧检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
结果1.基本情况：发现阶段为4对病例组和对照组，其中均为男童3人，女童1人。验证阶段为病例组和对照组111对，两组中各有男童69人（62.2%），女童42人（37.8%）。发现阶段两组患儿各变量间的差异均无统计学意义（P＞0.05）。验证阶段两组在年龄、性别、胎次、孕龄、母亲孕期杀虫剂接触史和居家附近有加油站的差异均无统计学意义（P＞0.05）。病例组中28人（25.2%）有儿童杀虫剂接触史、35人（31.5%）居住于新刷油漆居所和24人（21.6%）有家族肿瘤史，高于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表 1。
2. miRNA表达谱芯片结果：以芯片表达水平30为阈值，≥30为有表达，＜30为无表达，芯片结果显示病例组中有195个miRNA表达水平＞30，对照组有120个miRNA表达水平＞30，其中有120个miRNA在两组中均可检出。共筛选出204个差异表达的miRNA，其中上调200个、下调4个（图 1）。
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| 注：横轴代表病例组和对照组间miRNA表达倍数的变化（log2转化），纵轴代表相应的P值（-log10转化）；纵绿线分别对应1.5倍的上调（右）和下调（左），绿平行线对应0.05的P值；红点代表在不同样品中差异有统计学意义的miRNA 图 1 急性淋巴细胞白血病病例组与对照组miRNA表达谱芯片的差异表达 |
3.选择miRNA进行人群验证：miRNA选择标准为：① 根据在病例组或对照组至少一组中miRNA的表达水平≥30，P＜0.05和两组样本间的表达差异倍数＞2；② 通过targetScanHuman 7.0（靶基因预测软件）、DAVID Bioinformatics Resources 6.8（生物功能注释信息平台）发现靶基因通路与癌症或ALL相关的miRNA；③ 文献报道可能与癌症或ALL相关的miRNA。同时满足上述条件1，并且满足条件2或者条件3的miRNA，最后纳入let-7f-5p、miR-5100、miR-25-3p和miR-3654，其在芯片中的表达见表 2，即let-7f-5p、miR-25-3p和miR-3654表达为上调，miR-5100表达为下调。
4.病例组与对照组中miRNA表达水平的比较：miRNA的相对表达量见图 2。在病例组和对照组中let-7f-5p、miR-5100、miR-25-3p相对表达量分别为-12.78±0.30和-11.10±0.32、-10.80±0.26和-8.99±0.31、-7.75±0.38和-5.40±0.28，病例组表达水平均低于对照组，差异均有统计学意义（t＝3.86，t＝4.42，t＝4.92，均P＜0.01）。miR-3654在病例组和对照组中的相对表达量分别为-18.06±0.32和-17.63±0.28，差异无统计学意义（t＝1.08，P＝0.277）。
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| 注：miRNA相对表达量是经log转换后的数据，框图中间的线为中位数，方框为四分位数间距的范围，上下两个细线之间的距离为1.5倍四分位数间距 图 2 急性淋巴细胞白血病病例组与对照组中miRNA的表达水平 |
5. miRNA与cALL发病风险的关联性：采用条件logistic回归分析miRNA与cALL发病之间的关联性。结果显示let-7f-5p、miR-5100和miR-25-3p表达水平上升与cALL发病风险下降有关，调整混杂因素后，上述3个miRNA仍然与cALL的发生存在关联（表 3）。
6. miRNA作为cALL分子生物标志物的分析：采用ROC分析let-7f-5p、miR-5100和miR-25-3p作为cALL分子标记物的可行性（表 4），结果显示传统危险因素的AUC及其95%CI为0.72（0.66~0.78）。let-7f-5p、miR-5100和miR-25-3p的AUC及其95%CI分别为0.65（0.58~0.72）、0.66（0.59~0.73）和0.69（0.62~0.77）。在传统危险因素的基础上纳入单个miRNA后，AUC及其95%CI分别上升至0.77（0.71~0.82）、0.78（0.72~0.83）和0.78（0.72~0.83），与传统危险因素模型相比差异均有统计学意义（P值分别为0.026、0.010和0.028）。另外，纳入2或3个miRNA的AUC及其95%CI分别为0.78（0.72~0.83）、0.78（0.72~0.83）、0.78（0.72~0.83）、0.78（0.72~0.84），大于传统危险因素，差异均有统计学意义（P值分别为0.009、0.023、0.013和0.012）。
重新分类分析方法结果显示，在传统危险因素基础上加入单个miRNA后，NRI及其95%CI分别为0.56（0.31~0.81）、0.41（0.16~0.67）和0.49（0.23~0.74），而IDI及其95%CI分别为0.06（0.03~0.09）、0.07（0.04~0.11）、0.09（0.05~0.13），与传统危险因素模型相比差异均有统计学意义（P＜0.01）。在传统危险因素基础上加入2或3个的miRNA，NRI及其95%CI分别为0.38（0.12~0.64）、0.41（0.16~0.67）和0.51（0.25~0.76）、0.54（0.29~0.79），而IDI及其95%CI分别为0.07（0.04~0.11）、0.09（0.05~0.13）、0.10（0.06~0.13）和0.10（0.06~0.14），与传统危险因素模型相比差异均有统计学意义（P＜0.01）。
7. miRNA在临床诊断分型中的表达：miRNA表达在初发cALL中危险度分层、FAB分型、免疫分型、融合基因中的表达情况见表 5。let-7f-5p、miR-5100和miR-25-3p在各变量组中的相对表达量的差异均无统计学意义（P＞0.05）。
8. miRNA与初发cALL一般情况的相关性分析：在初发cALL人群中，对miRNA与各变量之间的相关性分析显示，let-7f-5p和miR-5100均与血小板计数存在负相关（r＝-0.24，P＝0.012）。miR-25-3p与各变量无相关性（表 6）。
目前cALL病因和发病机制尚未明确，故及早诊断和临床治疗对降低病死率具有重要公共卫生学意义。本研究通过miRNA表达谱芯片技术检测4对匹配的cALL病例和对照，筛选出一系列具有差异表达的miRNA，并挑选出let-7f-5p、miR-5100、miR-25-3p和miR-3654进行人群验证，发现初发cALL患者血浆中let-7f-5p、miR-5100、miR-25-3p表达水平低于对照组，且高水平表达的let-7f-5p、miR-5100、miR-25-3p与cALL患儿发病风险下降有关。此外，在传统危险因素基础上引入let-7f-5p、miR-5100、miR-25-3p增加了诊断的准确性。因此，初步推测，血浆中let-7f-5p、miR-5100、miR-25-3p可作为cALL的生物标志物。目前，let-7家族调控mRNA的作用机制尚不清楚，可能在多种肿瘤中表达水平均表现为下调，起着抑癌基因的作用[10-11]。研究表明，let-7b是MLL重排型ALL中显著下调的miRNA之一，而高表达的let-7b会抑制白血病细胞增长[12]，也有研究提示let-7f在难治性急性髓性白血病细胞中低表达[13]。有研究表明let-7f-5p可作为卵巢癌[14]和结直肠癌[15]的早期诊断生物标志物。但对miR-5100与疾病之间关联的研究较少，有研究发现miR-5100在肺癌组织中高表达[16]，而高表达的miR-5100可促进癌细胞的扩增。另外研究表明miR-25可以抑制肿瘤细胞凋亡[17]，并在多种癌症中均有异常表达，如miR-25-3p可作为早期诊断甲状腺乳头状癌[18]和结直肠癌[19]的生物标志物，但到目前为止尚缺乏对cALL的研究。国内有研究报道miR-25与成年人急性髓性白血病患者整体生存率相关[20]，但也有研究发现miR-25与对照组相比在急性髓性白血病患儿中未发现明显的差异表达[21]。
本研究选取let-7f-5p、miR-5100、miR-25-3p可较好区分病例组与对照组的不同疾病状态，并用ROC分析了血浆miRNA诊断cALL的效能。结果显示3个miRNA作为cALL生物标记物具有较好的准确度（AUC＞0.65）。在传统危险因素的基础上纳入1或≥2个miRNA均能增加诊断的准确性（AUC＞0.77）。重新分类分析结果显示与传统危险因素模型相比，加入1或≥2个miRNA后，模型诊断均可增加其应用价值（P＜0.01）。因此，初步推测血浆let-7f-5p、miR-5100、miR-25-3p结合传统危险因素可作为诊断cALL的生物标志物。有研究表明miRNA表达与特定的细胞遗传学变化相关[22]，白血病患儿细胞若含TEL-AML1融合基因，则提示对治疗反应好、预后佳，而如果含MLL基因重排和BCR-ABL1融合基因则提示预后不良。本研究发现3种miRNA在融合基因阳性组与阴性组中表达均无差异。在危险度分层、FAB分型和免疫表型识别方面，3种miRNA在初发cALL患者不同亚型中的表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。无法通过这3种miRNA的表达水平来区分cALL患者的危险度分层、FAB分型和免疫表型。本文显示let-7f-5p、miR-5100与血小板有相关性，提示该2种miRNA可能与血小板的生成有关，其机制有待进一步研究。
环境化学物暴露可通过基因组的表观遗传变异产生潜在的毒理学作用，导致可遗传的表型改变和环境相关疾病的发生[23]。一项研究发现苯作业工人let-7f-5p表达水平明显高于对照组[24]。本研究相关分析并未得到let-7f-5p与环境化学物暴露相关的结论，可能是暴露方式不一致。一项对儿童急性白血病发病影响因素的病例对照研究发现，DNA甲基化与环境因素暴露在儿童急性白血病发病过程中存在交互作用[25]，然而对miRNA与环境化学物暴露在cALL中可能存在的交互作用的报道较少。
本研究存在不足。如对照组为新入院的骨折创伤患儿，而动物模型显示[26]，大鼠骨折时其miR-29b-3p的表达可促进骨折愈合和机械性能的改善，但目前尚无人群资料支持；此外，本研究结果是基于回顾性的问卷调查，可能存在回忆偏倚。
综上所述，let-7f-5p、miR-5100、miR-25-3p表达水平上升可使cALL的发病风险下降，有可能作为诊断cALL的生物标志物。本课题组前期发现，苯等多种环境化学物暴露可能增加cALL的发病风险[27]。下一步计划从环境-表观遗传角度，探讨环境化学物暴露与miRNA及其在cALL发病中的交互作用，为其病因预防提供理论依据。
志谢: 感谢深圳市儿童医院在研究中给予的支持与帮助利益冲突: 无
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