沙粒病毒（Lassa virus）是一类以啮齿动物为主要宿主的单股负链RNA病毒，其基因组由2个节段（S和L）组成。目前已确定的沙粒病毒有30种，根据地理分布、抗原性和序列差异，分为新世界和旧世界两大群^[1]。沙粒病毒可导致以出血热和脑炎症状为主的多种严重人类疾病。如拉沙病毒每年在非洲地区可导致30万至50万人感染，5 000人死亡^[2]。在南美洲，胡宁病毒（Junin virus）、马秋波病毒（Machupo virus）、萨比亚病毒（Sabia virus）、Chapare病毒分别引起阿根廷出血热、玻利维亚出血热、委内瑞拉出血热和巴西出血热^[3-5]。在亚洲，目前已知的沙粒病毒仅有淋巴脉络丛脑膜炎病毒（Lymphocytic choriomeningitis virus，LCMV）和2015年本研究组在温州地区发现的温州病毒（Wenzhou virus，WENV）^[6-7]。后者系一种新型沙粒病毒，也是自20世纪30年代以来在欧亚大陆上发现的第二种沙粒病毒。最新研究发现WENV能引起人呼吸道疾病^[8]。为进一步研究WENV的遗传特征及其流行，对温州和龙泉地区啮齿动物中WENV的流行情况开展调查，并对其全基因组序列进行遗传进化分析。

材料与方法

1.样本来源：2013年在温州市文成地区和龙泉市采用笼捕法捕鼠，经形态学和分子生物学鉴定后，采集其粪便样本，置冻存管-80 ℃保存。

2. RNA提取：使用德国Qiagen公司的总RNA提取试剂盒提取动物粪便总RNA，置于-80 ℃备用。

3. RT-PCR检测及序列扩增：参照以往的检测方法，使用已有的引物序列^[7]，采用巢式RT-PCR方法检测鼠粪便中病毒RNA。选取阳性样品，根据GenBank中沙粒病毒末端保守序列扩增阳性样品病毒全基因组（S和L节段）。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。序列测定由北京擎科新业生物技术有限公司完成。

4.核苷酸、蛋白序列和系统进化树分析：使用DNAStar软件对获得的序列进行编辑及同源性分析，用Clustal X软件转换序列格式。用PhyML 3.1软件构建系统进化树（用于分析的其他毒株序列来自GenBank）。

结果

1.病毒检测：2013年在温州地区采集的48份啮齿动物样本，有5份检测到病毒RNA阳性，其中4份源自褐家鼠，1份来自黄胸鼠，病毒携带率为10.41%。分别用S和L节段末端及中间区域保守序列设计引物，获得5份样品（Wencheng-Rn-232、Wencheng-Rn-288、Wencheng-Rn-337、Wencheng-Rn-343及Wencheng-Rf-250）病毒基因组的全长或接近全长序列。但在龙泉地区采集的156份啮齿动物样本中未检测到相同病毒。

2. S与L节段分析：

（1）同源性和进化分析：5株病毒的S节段全长在3 210~3 241核苷酸之间，L节段全长在6 764~6 880核苷酸之间，与典型沙粒病毒基因组序列长度一致。与已知的沙粒病毒序列比对发现，与已知WENV同源性最高，S节段同源性为88.0%~99.0%，L节段为94.0%~99.0%。选取国内先前报道的Wencheng-Rf-366毒株（WENV）和Armstrong 53b毒株（LCMV）序列作为参照，计算不同毒株序列的遗传距离。结果显示，Wencheng-Rn-232、Wencheng-Rn-337、Wencheng-Rn-343、Wencheng-Rf-250毒株间同源性＞99%，与已知的Wencheng-Rf-366株核苷酸序列同源性也在97%~99%之间（表 1）。而Wencheng-Rn-288毒株与其他已知WENV的序列差异较大，S和L节段与已知WENV的同源性分别为87.5%和91.6%，与国内已有的LCMV同源性分别为56.3%和50.1%，与拉沙病毒同源性分别为62.0%和53.9%。表明Wencheng-Rn-288毒株可能为WENV一个新亚型。选择旧世界群沙粒病毒代表株及新世界群的Whitewater Arryo virus（WWAV）作为外群，分别构建S和L节段进化树。如图 1所示，此次发现的病毒（Wencheng-Rn-232、Wencheng-Rn-337、Wencheng-Rn-343、Wencheng-Rf-250）均与之前报道的WENV聚集在一起，有很高的亲缘关系。而病毒株Wencheng-Rn-288在进化树上构成独立的分支，为在柬埔寨发现的WENV另一分支。

（2）遗传特征分析：对所获得5株病毒分析其S和L节段遗传特征，结果显示S和L节段末端均有典型的沙粒病毒末端保守序列（表 2），L节段5′端为：5-CGC ACC GGG GAT CCT AGG CAA AGT GGT TAT CT-3，3′端为：5-CCT CTA CAC TGA GAG ATT CAG AGT TG-3；S节段5′端为：5-AGG GGA TCC TAG GCC TTT TTG GTT GCG CAT ATA AA-3，3′端为：5-CAA TTC GCC ATG AAA ATG CCT AGG ATC CCC-3。蛋白序列分析表明，5株病毒的核蛋白均有典型的核苷酸外切酶区域，而糖蛋白也具有典型的细胞质区（cytoplasmic region），均与以往发现的WENV及其他沙粒病毒一致。分析基因间非编码区域（intergenic region），显示Wencheng-Rn-232、Wencheng-Rn-337、Wencheng-Rn-343、Wencheng-Rf-250的S和L节段基因间区域长度也均与已报道的WENV完全一致，分别为61 bp和120 bp。而Wencheng-Rn-288毒株则与其他毒株存在较大差异，长度分别为39 bp和124 bp。为了解其对人的可能致病性，选取与对人致病的拉沙病毒、LCMV和柬埔寨的WENV毒株进行对比。结果表明，WENV各毒株的糖蛋白序列与LCMV糖蛋白同源性为52.0%~53.0%，与拉沙病毒糖蛋白同源性约为73.0%，而与柬埔寨检测到的WENV亚型C617、C621和C649毒株糖蛋白同源性则高达91.2%~95.2%。表明我国的WENV毒株有可能发生跨物种传播造成人类感染。

讨论

目前已知的致病性沙粒病毒多分布在非洲和南美洲，如拉沙病毒、Lujo病毒、胡宁病毒、马秋波病毒、萨比亚病毒、Chapare病毒等^{[2-5, 9]}，多以出血热为主要症状。2015年以前在欧亚大陆唯一发现的沙粒病毒为LCMV，可致人脑炎^[6]。2015年我们在温州地区啮齿动物和食虫类动物中首次发现一种新的沙粒病毒，命名为WENV^[7]，并得到世界病毒分类委员会（ICTV）认可^[10]。Blasdell等^[8]2016年报道了流行在东南亚地区的WENV变种，并在柬埔寨发现可感染人，引起发热、头痛、流涕、咳嗽、胃部不适等症状。分析发现，柬埔寨流行WENV毒株的L与S节段与我国报道的WENV同源性分别高达87.5%~88.6%和87.5%~89.8%^[10]。本研究再次在温州市文成地区啮齿类动物中发现了5株WENV及其新亚型，证明沙粒病毒在温州地区啮齿类动物中的流行。

龙泉地区虽与温州同属浙江省南部，但在该地区的鼠类样本中未检测到沙粒病毒，而温州地区则有较高的检出率（10.41%），可能与两地独特的地理地貌有关。多山地区易形成物理障碍限制了宿主动物的迁移，从而造成WENV的地理聚集现象。此外，不同宿主动物中（褐家鼠、黄胸鼠、鼩鼱等）均检出WENV，也说明病毒宿主动物的多样性。

对5株病毒的全基因组序列分析发现，其中4株与已报道的WENV在系统发生树上处于同一进化分支，具有相同或相似的遗传特征。而Wencheng-Rn-288株则与其他毒株存在一定差异，在进化树上位于另一个分支，L和S节段与其他WENV毒株核苷酸同源性分别为89.9%~91.6%和87.1%~87.5%。表明该病毒株系WENV一个新亚型，提示在该地区动物中WENV具有很长的进化历史。

人类传染病多源于动物^[11]，70%以上新发传染病是由野生动物携带的病毒引起^[12]。我国野生动物种类繁多，分布广泛，是多种人类病原体的储存库。随着人类活动日渐频繁，未来野生动物源病原体对人类构成重大威胁。本研究发现温州地区啮齿动物中WENV流行率高，其中褐家鼠为主要宿主。而后者在我国分布广泛，是居民区的优势鼠种，与人类接触密切。因此应加强对啮齿类动物WENV流行的监测，并研究其感染性和致病性，评估引起新发传染病的风险。

利益冲突: 无