中华流行病学杂志  2015, Vol. 36 Issue (4): 374-378   PDF    
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0254-6450.2015.04.017
中华医学会主办。
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李颖, 付育红, 原梅, 董玲玲, 黄海荣, 李卫民, 高基民. 2014.
Li Ying, Fu Yuhong, Yuan Mei, Dong Lingling, Huang Hairong, Li Weimin, Gao Jimin. 2014.
四川盆地结核分枝杆菌群体遗传学特征研究
Study on the population-genetics of Mycobacterium tuberculosis from Sichuan Basin in China
中华流行病学杂志, 2015, 36(4): 374-378
Chinese Journal of Epidemiology, 2015, 36(4): 374-378
http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0254-6450.2015.04.017

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投稿日期:2014-10-04
四川盆地结核分枝杆菌群体遗传学特征研究
李颖1, 付育红2, 原梅1, 董玲玲2, 黄海荣2, 李卫民2 , 高基民1     
1. 325035 温州医科大学检验医学院生命科学学院 浙江省模式生物技术与应用重点实验室;
2. 首都医科大学附属北京胸科医院北京市结核病胸部肿瘤研究所 国家结核病临床实验室
摘要目的 探讨四川盆地(重庆、四川地区)流行的结核分枝杆菌(MTB)群体遗传学特征。方法 对413株源自四川盆地的MTB进行长序列多态性(LSP)谱系鉴定, 采用χ2检验分析不同谱系MTB在人群中的分布差异。对菌株进行15位点数目可变串联重复序列基因分型, 评价各位点的分辨力。构建N-J树分析其系统进化;构建最小跨度树以模拟群体菌株的遗传结构;采用分子方差分析不同谱系MTB的群体间遗传分化;采用贝叶斯模型计算菌株最近共祖年代。结果 通过LSP可将413株MTB分为两大谱系, 其中北京谱系占56.2%(232/413), 欧美谱系占43.8%(181/413)。两谱系MTB在人群中的分布(性别、年龄、民族以及菌株耐药性)差异无统计学意义(P>0.05)。北京谱系MTB的N-J树呈放射状分布, 最小跨度树中有72.4%(168/232)的菌株被划分到同一“克隆复合群”;欧美谱系MTB的N-J树呈枝状分布, 最小跨度树中呈现出多个“克隆复合群”。北京谱系MTB在该地区有显著的群体间遗传分化(FST=0.018 91, P<0.05), 而欧美谱系MTB群体间遗传分化不显著(FST=0.005 19, P>0.05)。欧美谱系MTB中最大菌株复合群的最近共祖年代为723(95%CI:517~946)年。结论 北京谱系和欧美谱系MTB在四川盆地以“互相对抗”形式流行;两谱系MTB的群体间遗传分化存在差异;欧美谱系MTB的侵入可能与一次历史事件(约720年前的战争)有关。
关键词结核分枝杆菌     长序列多态性     欧美谱系     群体遗传学    
Study on the population-genetics of Mycobacterium tuberculosis from Sichuan Basin in China
Li Ying1, Fu Yuhong2, Yuan Mei1, Dong Lingling2, Huang Hairong2, Li Weimin2 , Gao Jimin1     
1. Zhejiang Provincial Key Laboratory for Technology and Application of Model Organisms, School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical University, Wenzhou 325035, China;
2. National Tuberculosis Clinical Laboratory of China, Beijing Tuberculosis and Thoracic Tumor Research Institute, Capital Medical University Affiliated Beijing Chest Hospital
Abstract: Objective To explore the population-genetics characteristics of Mycobacterium tuberculosis (MTB) prevailing at the Sichuan basin of China. Methods A total of 413 MTB strains collected from Sichuan basin were genotyped by large sequence polymorphism (LSP) and 15 loci variable number tandem repeat(VNTR). Difference between the distribution of lineage population was analyzed by χ2-test and the discriminatory ability of each VNTR locus was evaluated under the Hunter-Gaston Discriminatory Index (HGI). Both phylogeny on population level and genetic structure were demonstrated through N-J tree and the Minimal Spanning Tree(MST). Genetic differentiation of different lineage strains was analyzed by Analysis of Molecular Variance(AMOVA). Time of the Most Recent Common Ancestor(TMRCA) was calculated based on the Bayesian model. Methods Four hundred and thirteen MTBs were divided into two major lineages, in which the Beijing lineage accounted for 56.2%(232/413) and the Euro-American lineage for 43.8%(181/413). There was no significant difference of population distribution between the two lineages (P>0.05). The N-J tree of Beijing lineage MTB presented distinctly “star-like” and 72.4% strains were grouped to one clonal complex in MST. The Euro-American lineages MTB presented “branch-like” in N-J tree and were grouped into multiple clonal complexes in MST. There was significant genetic differentiation in Beijing lineage MTBs between Chongqing and Sichuan (FST=0.018 91, P<0.05), but not in the Euro-American lineage MTB(FST=0.005 19, P>0.05). TMRCA of the largest clonal complex in Euro-American lineage MTB appeared to be 723(95%CI:517-946) years. Conclusion Both Beijing lineage and Euro-American lineage MTBs were competitively prevalent in the Sichuan basin. There was some difference noticed between the two lineages referring to genetic differentiation. The invasion of Euro-American lineages MTB to the basin area might be associated with a war occurred in this area about 720 years ago.
Key words: Mycobacterium tuberculosis     Large Sequence Polymorphism     Euro-American lineage     Population genetics    

结核分枝杆菌(MTB)是结核病的病原菌。据 WHO统计[1],我国结核病患病人数及耐药菌感染 人数均居全球第二,而我国西南地区结核病疫情较 严重,其中四川盆地(重庆、四川地区)由于其独特 的人文地理位置,结核病疫情对整个地区的影响不 容忽视。前期Li 等[2]采用Spoligotyping 分型技术 将四川地区292 株MTB 分为北京谱系(54.8%)和 非北京谱系(45.2%)两个大群。但有关该地区 MTB群体遗传结构以及群体间遗传分化的研究未 见报道。为此本研究采用长序列多态性(large sequence polymorphism,LSP)和15 位点数目可变串 联重复序列(variable number tandem repeat,VNTR) 两种基因分型技术,对收集自四川盆地的413 株 MTB 进行群体遗传学特征分析,探讨该地区MTB 的流行特征。 材料与方法

1. 实验菌株:432 株MTB取自2007-2008 年全 国结核病耐药基线调查中重庆市和四川省分离株 [3],由国家结核病临床实验室提供。其中重庆市包 括丰都县(采样点收集60 株/本研究纳入60 株,60/ 60)、奉节县(67/67)2 个采样点;四川省包括峨眉山 市(60/54)、通江县(62/62)、武胜县(65/61)、江油市 (58/53)、涪城区(60/56)5 个采样点。因19 株MTB 复苏未成功而舍弃,最终413 株(95.6%)MTB 纳入 研究。

2. 试剂和仪器:2 × Taq Master Mix、100 bp Ladder 以及RD105 鉴定北京谱系MTB试剂盒均购 自北京康为世纪生物科技有限公司;Bio Numerics 5.0分析软件购自比利时Applied Maths公司。

3. LSP 鉴定谱系:参照文献[4, 5]选定RD105、 RD239、RD702、RD711、RD750 以及pks15/1Δ7 bp 共 6 个DNA 片段作为MTB 谱系定义靶标,针对每一 RD 片段分别进行PCR 扩增,以检测相应片段有无 缺失鉴定MTB谱系。其中北京谱系MTB的鉴定采 用RD105 商品化试剂盒;对经鉴定的北京谱系MTB 进一步行RD181 为靶标的“古老”或“现代”亚谱系 分型[6]。pks15/1Δ7 bp 引物设计参照文献[5],扩增 该目的基因可分别获得398 bp(缺失7 个碱基)和 405 bp(完整)两种片段长度的扩增产物,欧美谱系 特异性缺失5′-GCCGCGG-3′7 个碱基。通过基因 测序比对完成欧美谱系MTB的鉴定。一株菌对应 一名病例,采用X2检验分析该地区不同谱系MTB在 人群性别、年龄、民族以及耐药情况上的差异是否具 有统计学意义(P<0.05)。

4. VNTR基因分型:采用标准15 位点VNTR基 因分型(VNTR-15)方法[7]。计算VNTR-15 对不同 谱系MTB的总体分辨力以及各VNTR位点的分辨 力(汉高分辨指数Hunter-Gaston Discriminatory Index,HGI)[8]

5. 群体遗传学分析:将413 株MTB 的LSP 和 VNTR数据一并上传至MIRU-VNTR数据库(http:// www.miru-vntrplus.org)与代表菌株进行比对分析。 结合VNTR-15 数据,以M. prototuberculosis(包含 M. canettii)为外群构建N-J 进化树;采用Bio Numerics 5.0 软件构建最小跨度树(minimun spanning tree,MST)。本研究将该地区不同谱系 MTB 分别设定为一个群体,采用Arlequin 3.5 软件 通过分子方差分析(analysis of molecular variance, AMOVA)计算成对群体间遗传分化系数(FST)[9],推 测对应群体之间是否存在显著的遗传分化。

6. 欧美谱系MTB 最近共祖年代的计算:前期 Comas 等[10]对全球范围内主要谱系MTB的起源进 化以及共祖年代进行较细致的研究,推测北京谱系 MTB起源于东亚地区,欧美谱系MTB起源于欧洲 大陆。Pepperell 等[11]推导了DS6QUE 欧美亚谱系 MTB通过法国人皮毛贸易由加拿大东海岸登陆并 跟随贸易活动向西海岸传播的过程。参照Pepperell 方法,采用贝叶斯模型,突变速率为10-3每 位点每代,增长速率为103每代,利用Ytime 软件计 算该群欧美谱系MTB的最近共祖年代(time of the most recent common ancestor,TMRCA)。 结果

1. LSP鉴定谱系:北京谱系占收集菌株的56.2% (232/413),欧美谱系占43.8%(181/413),未发现其 他谱系MTB。两谱系MTB 与MIRU-VNTR 数据 库中的北京谱系和欧美谱系MTB 代表菌株汇聚 良好。北京谱系MTB 中“现代”亚谱系所占比例 为90.9%(211/232),“古老”亚谱系仅占9.1%(21/ 232)。结合国内现有研究数据,设计适合我国MTB 的LSP谱系鉴定流程图(图 1)。经χ2检验验证,该地 区两谱系MTB在人群性别、年龄、民族分布以及耐 药上的差异无统计学意义(P>0.05)(表 1)。

图 1 LSP谱系鉴定流程

表 1 3个亚组各参数的估计结果

2. VNTR-15 基因分型的分辨力:VNTR-15 将 232 株北京谱系MTB和181 株欧美谱系MTB分为 210 和175 个基因型,HGI 分别为0.998 6 和0.999 6。 QUB11b、QUB26、Mtub21、MIRU26 位点对该地区 北京谱系和欧美谱系MTB 均具有较高的分辨力 (HGI>0.5);MIRU04、MIRU40、MIRU16、ETR-A、 Mtub39 位点对该地区欧美谱系的分辨力均高于北 京谱系MTB(表 2)。

表 2 四川盆地不同谱系MTB中VNTR-15各位点的HGI比较

3. 系统发育分析:232 株北京谱系MTB 的N-J 树呈“放射状”分布(图 2),提示这些菌株可能由 某一“克隆”进化而来;MST中有72.4%(168/232)的 菌株被划分到同一“克隆复合群”(图 3),表明该 群北京谱系MTB的克隆扩展能力较强。欧美谱系 MTB的N-J 树呈“枝状”分布(图 2),提示这 些菌株可能是“多克隆”起源;MST显示有多 个较明显的“克隆复合群”,其中最大的克隆 复合群包含39.2%(71/181)的菌株(图 3)。

图 2 232株北京谱系MTB()和181株欧美谱系MTB()基于VNTR-15的系统发育N-J树

图 3 232株北京谱系MTB()和181 株欧美谱系MTB()基于VNTR-15 的MST

4. 群体菌株间的分子方差分析:就北京 谱系MTB而言,重庆、四川两群菌株群体间 遗传分化较显著(FST=0.018 91,P<0.05); 就欧美谱系MTB而言,重庆、四川两群菌株 群体间遗传分化不显著(FST=0.005 19,P> 0.05)。以全部菌株为总体,计算北京谱系与 欧美谱系MTB 之间的FST,得到显著的P 值 (FST=0.304 09,P=0.000),两谱系MTB群体 间遗传分化显著。

5. 针对欧美谱系MTB的TMRCA计算:选定欧 美谱系MTB中最大的菌株复合群(共71株,处于N-J 树同一进化分支,在MST中属于同一克隆复合群)进 行共祖年代计算,得到TMRCA为723(95%CI:517~ 946)年。 讨论

LSP 是基于MTB 基因组中分化区(region of difference,RD)的缺失而建立的谱系鉴定技术,通过 该技术可将全球的MTB分为6 大谱系,即环印度洋 系、北京谱系、欧美谱系、东非-印度系、西非-1 系、 西非-2 系,且每个谱系MTB均与对应的地理人群存 在着一定联系[5, 12]。本研究采用LSP 对四川盆地的 413 株MTB 进行谱系鉴定,得到北京(56.2%)和欧 美(43.8%)两个谱系。结合我国MTB的总体流行情 况,北京谱系MTB是我国主流流行菌(流行比例约 为62.2%,南北地区略有不同[13]),欧美谱系MTB在 我国亦有一定程度的流行,而西非谱系MTB几乎未 在我国发现[12],因此设计了适合我国MTB谱系鉴定 的LSP流程图。该地区北京谱系与欧美谱系MTB在 人群年龄、性别、民族分布以及耐药性上的差异无统 计学意义,提示欧美谱系MTB与当地宿主人群的联 系和北京谱系MTB基本一致。本研究表明,在四川 盆地欧美谱系与北京谱系MTB呈“相互对抗”式的流 行,与东、中部地区北京谱系MTB高水平的流行特征 不同[14, 15];欧美谱系MTB和该地区宿主人群的联系 与Gagneux 等“其与欧美人群存在稳定联系[12]”的结 论不同。因此有必要以群体遗传学为切入点,探讨导 致该地区较为特殊的MTB流行现状的原因。

本研究中VNTR-15 对该地区两谱系MTB的总 体分辨力均较高。北京谱系MTB在该地区呈现出 较强的克隆扩展状态;而欧美谱系MTB则趋向于多 克隆、多中心起源状态。前期研究表明北京谱系 MTB无论是在东亚还是在美洲大陆等地区其菌株 群均呈克隆状态扩展[14, 16];欧美谱系MTB则由于谱 系内亚型较多以及欧美国家人口密度较小等因素导致其多呈枝状扩展[17];可见该地区流行的北京谱系和 欧美谱系MTB的群体遗传结构并未发生明显改变。

本研究将四川盆地分成重庆、四川两个地区进 行分析,以期能够发现该地区北京谱系和欧美谱系 MTB的群体间遗传分化是否存在差异。分子方差 分析显示,北京谱系MTB在重庆、四川两地区间存 在较显著的群体间遗传分化,而欧美谱系MTB的群 体间遗传分化不显著。前期研究表明,北京谱系 MTB起源于东亚,早在新石器时代(约8 000 年前) 就已在我国出现,且随着现代人的不断繁衍迁移在 东亚大范围扩展[10];北京谱系MTB在接下来的历史 长河中可能先后遇到了不同的自然选择压力和不同 的群体内遗传漂变以及有限范围内的基因漂流等多 重因素,从而导致不同地区菌株间出现了较显著的 遗传分化。欧美谱系MTB起源于欧洲大陆,且遗传 多样性较大[10],这一特点使其作为外来物种能够更 好地适应新的环境,可能是其成功入侵定植的原因 之一;欧美谱系MTB作为入侵物种可能在随后较短 的时间内遇到了较为一致的自然选择压力以及来自 当地北京谱系MTB的“挤压”,从而导致不同地区菌 株间遗传分化不显著。分析该地区欧美谱系MTB 主要菌株复合群的最近共祖年代为720 年,结合该 地区特殊的地理历史(重庆市合川区钓鱼城)[18],本 研究据此推测:700 多年前的合川钓鱼城战争,即公 元1260 年(宋末元初)蒙古铁骑从征战中的欧洲大 陆收兵,全力攻打巴蜀咽喉合川钓鱼城,战争持续 36 年之久,而蒙古骑兵很可能也将欧洲大陆较为流 行的欧美谱系MTB带到该地区,并此后随人类活动 传播扩展。

我国由于北京谱系MTB流行程度高,因此忽视 了流行程度较低但在欧美国家呈高水平流行的欧美 谱系MTB的研究。本研究以四川盆地北京谱系和 欧美谱系MTB呈“对抗”式流行现象为切入点,设计 了适合我国MTB的LSP谱系鉴定流程图,并发现该 地区北京谱系与欧美谱系MTB在群体遗传结构以 及群体间遗传分化上存在差异;计算最近共祖年代 推测出欧美谱系MTB可能的入侵年代。此结果有 助于探讨北京谱系、欧美谱系乃至整个MTB复合群 的生物进化机制,为当地乃至全国结核病防治提供 科学依据。

参考文献
[1] WHO. Global tuberculosis control: a short update to the 2009 report[R]. Global Tuberculosis Control, Geneva:World Health Organization, 2009.
[2] Li X, Xu P, Shen X, et al. Non-Beijing strains of Mycobacterium tuberculosis in China[J]. J Clin Microbiol, 2011, 49(1):392-395.
[3] The Ministry of Health of the People's Republic of China. The national TB drug resistance baseline survey report (2007-2008)[M]. Beijing:People's Medical Publishing House, 2010:1-230.(in Chinese)中华人民共和国卫生部. 全国结核病耐药性基线调查报告(2007-2008年)[M]. 北京:人民卫生出版社, 2010:1-230.
[4] Gagneux S, DeRiemer K, Van T, et al. Variable host pathogen compatibility in Mycobacterium tuberculosis[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2006, 103(8):2869-2873.
[5] Martinez-Gamboa A, Ponce-de-Leon A, Galindo-Fraqa A, et al. Molecular analysis of Mycobacterium tuberculosis strains with an intact pks15/1 gene in a rural community of Mexico[J]. Arch Med Res, 2008, 39(8):809-814.
[6] Tsolaki AG, Gagneux S, Pym AS, et al. Genomic deletions classify the Beijing/W strains as a distinct genetic lineage of Mycobacterium tuberculosis[J]. J Clin Microbiol, 2005, 43(7):3185-3191.
[7] Supply P, Allix C, Lesjean S, et al. Proposal for standardization of optimized mycobacterial interspersed repetitive unit VNTR typing of Mycobacterium tuberculosis[J]. J Clin Microbiol, 2006, 44(12):4498-4510.
[8] Hunter PR, Gaston MA. Numerical index of the discriminatory ability of typing systems:an application of Simpson' s index of diversity[J]. J Clin Microbiol, 1988, 26(11):2465-2466.
[9] Weir BS, Hill WG. Estimating F-statistics[J]. Ann Rev Genet, 2002, 36:721-750.
[10] Comas I, Coscolla M, Luo T, et al. Out-of-Africa migration and Neolithic co-expansion of Mycobacterium tuberculosis with modern humans[J]. Nat Genet, 2013, 45(10):1176-1182.
[11] Pepperell CS, Granka JM, Alexander DC, et al. Dispersal of Mycobacterium tuberculosis via the Canadian fur trade[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2011, 108(16):6526-6531.
[12] Hirsh AE, Tsolaki AG, DeRiemer K, et al. Stable association between strains of Mycobacterium tuberculosis and their human host populations[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2004, 101(14):4871-4876.
[13] Pang Y, Zhou Y, Zhao B, et al. Spoligotyping and drug resistance analysis of Mycobacterium tuberculosis strains from national survey in China[J]. PLoS One, 2012, 7(3):e32976.
[14] Ding PJ, Hui M, Liang Q, et al. Origin, phylogeny, and spread of Mycobacterium tuberculosis Beijing lineage in the five provinces of northern China[J]. Chin J Epidemiol, 2013, 34(4):374-378.(in Chinese)丁朋举, 惠明, 梁倩, 等. 中国北方部分地区北京谱系结核分枝杆菌群体遗传关系的分析[J]. 中华流行病学杂志, 2013, 34(4):374-378.
[15] Dai GM, Zhang ZG, Ding PJ, et al. Differences in the population of genetics of Mycobacterium tuberculosis between urban migrants and local residents in Beijing, China[J]. Chin Med J, 2013, 126 (21):4066-4071.
[16] Glynn JR, Whiteley J, Bifani PJ, et al. Worldwide occurrence of Beijing/W strains of Mycobacterium tuberculosis:a systematic review[J]. Emerg Infect Dis, 2002, 8(8):843-849.
[17] Rindi L, Medici C, Bimbi N, et al. Genomic variability of Mycobacterium tuberculosis strains of the Euro-American lineage based on large sequence deletions and 15-locus MIRU-VNTR polymorphism[J]. PLoS One, 2014, 9(11):e114676.
[18] Xiao W. The miracle in cold war period:the war of Hechuan Fishing Town[J]. Hist Refer, 2011(1):60-63. (in Chinese)小兀. 冷兵器战争的奇迹:合川钓鱼城之战[J]. 文史参考, 2011(1):60-63."