辽宁省2006年血清流行病学调查显示1～59岁人群HBsAg调整阳性率为5.50%^[1]，与1992年调查结果（8.79%）比较下降了3.29%^[2]，表明预防控制已取得显著成效，但仍有新发病例。HBV感染者的自然史特点和制定免疫接种、抗病毒治疗等防控措施均与病毒基因型及其变异情况有关^[3]。了解新发病例感染HBV特征，特别是其主蛋白抗原主要亲水区（MHR）的变异，对防控有重要意义。为此本研究分析辽宁省乙型肝炎（乙肝）监测病例HBV基因型分布特点及其主蛋白抗原MHR的氨基酸（aa）位点变异，为当地制定免疫规划方案提供依据。

1. 研究样本：按照全国乙肝监测项目方案要求，即所选县（区）常住人口＞30万或2011年乙肝报告病例数不少于200例，在辽宁省内选取城乡各3个县（区）作为乙肝监测试点。本文研究对象为乙肝监测试点县（区）医院2013年1－6月通过传染病网络直报系统上报，且进行抗-HBc IgM检测的所有乙肝监测病例。

2. 研究方法：

（1）抗-HBc IgM检测：采用美国雅培公司ARCHITECT i2000型自动酶免疫分析仪及配套试剂盒（ARCHITECT Anti-HBc IgM Reagent Kit）。使用化学发光微粒子免疫检测法。

（2）核酸提取、基因扩增及测序：采用德国QIAGEN公司生产的QIAamp DNA Blood Mini Kit，严格按照试剂盒说明书操作提取HBV DNA。利用半巢式PCR扩增HBV S基因片段，扩增及测序引物为SF1：5′-CCT GTA TTT TCC TGC TGG TGG CTC C-3′，SR1：5′-GCA GCA AAG CCC AAA AGA CCC-3′，SR2：5′-GCA GCA AAG CCC AAA AGA CCC-3′。首先使用外侧引物SF1/SR1。反应体系为10×PCR缓冲液5 μl、三磷酸碱基脱氧核苷酸（dNTP）混合物4 μl、100 pmol/μl引物各1 μl、Taq聚合酶（Taq 酶）0.25 μl、DNA模板5 μl，加双蒸水（ddH₂O）至50 μl。反应条件为94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、 52 ℃ 30 s、 72 ℃ 30 s，30个循环； 72 ℃ 10 min。将目的条带的扩增产物送华大公司测序，测序引物为SF1。第一轮未得到目的条带，以第一轮反应产物为模板，继续使用内侧引物SF1/SR2完成反应。反应体系为10×PCR缓冲液5 μl、dNTP混合物4 μl、100 pmol/μl引物各1 μl、Taq酶0.25 μl、第一轮PCR产物1 μl，加ddH₂O至50 μl。反应条件退火温度54 ℃，其他同第一轮，扩增产物送华大公司测序，测序引物SF1/SR2。

（3）生物信息学分析：依据既往文献^{[4, 5, 6]}，参考国家生物技术信息中心（NCBI）收录的HBV基因序列，选取HBV参考株进行核苷酸同源性比对分析。生物信息学分析软件选用Mega 5.0和Bioedit 7.0。采用邻位连接法（Neighbor-Joining，NJ）构建系统发生树，可信度评估采用1 000 bootstrap值，确定HBV基因型。B、C、D基因型HBV MHR aa参考位点及变异位点均参考文献^{[5, 6, 7, 8, 9]}确定，HBV S基因测序结果与参考序列比对分析，绘制HBV主蛋白抗原MHR aa位点置换及变异图。

3. 统计学分析：乙肝监测数据信息采用Microsoft Excel软件建立数据库，统计分析采用SPSS软件进行，包括χ²检验及Fisher精确检验。

1. 病毒S基因序列进化分析：2013年1－6月辽宁省乙肝监测试点县（区）共报告乙肝病例93例，其中81例成功扩增S区序列（片段长度为678 bp），并与NCBI下载的S基因参考序列比对，得到系统进化树（图 1）。B、C、D基因型分别占8.64%（7例）、86.42%（70例）和4.94%（4例）。

注：◆为参考序列图 1 辽宁省乙肝监测病例HBV S基因序列进化分析

图选项

2. 基因型分布特点：对81例乙肝病例检测基因型，其基因型分布在以年龄、性别、ALT水平、抗-HBc IgM（＋/-）、临床初次诊断结果分类比较中的差异均无统计学意义（表 1）。

表 1 辽宁省乙肝监测病例HBV基因型分布

注：均为确切概率法

表选项

3. 主蛋白抗原MHR aa位点置换情况：HBV主蛋白抗原MHR位于S基因99～169位aa，α抗原决定簇位于S基因124～147位aa。图 2为乙肝监测病例HBV主蛋白抗原MHR分别与参考序列比对结果，aa位点分布如图 2。B基因型序列变异位点为Q129H、T143M、A159V；C基因型序列变异位点为Y100C、Q101K、T113S、S117T、I126S/N、T126I、P127T、A128V、Q129H、G130N、T131N、M133T、G145R、F158S、A159G、V168A；D基因型序列变异位点为S113T、T126I、Y134F、S143L、G159A。所有乙肝监测病例的HBV主蛋白抗原MHR aa位点总变异率为4.87%，126 aa变异率最高为8.64%（图 3）。

图 2 辽宁省乙肝监测病例HBV S基因主蛋白抗原MHR aa位点分布

图选项

图 3 辽宁省乙肝监测病例HBV S基因主蛋白抗原MHR aa位点变异率

图选项

4．HBV S基因主蛋白抗原MHR变异株分布：81例中HBV 主蛋白抗原MHR变异株总流行率为49.38%。在不同年龄、性别、基因型和抗-HBc IgM（＋/-）分类比较中，差异无统计学意义，但在ALT正常组（＜43 IU/L）该流行率显著高于ALT异常组（≥43 IU/L），差异有统计学意义（表 2）。

表 2 辽宁省乙肝监测病例HBV S基因主蛋白

注：a为确切概率法

表选项

我国自1992年将乙肝疫苗纳入儿童计划免疫管理，2002年正式纳入国家计划免疫。随着新生儿乙肝疫苗接种率逐年提高，我国乙肝HBsAg流行率显著降低，但在国家法定报告传染病直报系统中，乙肝报告病例数多年来仍居全国法定传染病首位，这与报告系统的敏感度提高有关，也与报告系统存在错报、重报有关^[10]。为此我国于2012年开始在全国各省开展急性乙肝监测试点。本研究分析了辽宁省乙肝监测病例HBV基因型分布及其主蛋白抗原MHR变异特点。

我国内地主要流行B、C、D基因型，北方地区以C型为主，南方地区以B型为主，D型多见于西藏、新疆等地区。乙肝自然史与基因型密切相关，HBV通过性和母婴传播则以B、C型居多^[11]。本文辽宁省乙肝监测点病例的HBV基因型分布以C型为主，B型次之，少部分为D型。既往研究结果显示，我国东北地区B基因型占12.9%、C基因型占84.4%、混合基因型及其他为2.7%^[12]，与本研究结果相似。

由于HBV/P蛋白聚合酶缺乏矫正功能，HBV在复制过程中存在较高的自然变异率，S基因编码的外膜蛋白免疫原性较强，在病毒感染和毒力形成中有重要作用。HBV主蛋白抗原MHR位于S基因99～169位aa，含有一系列构象性抗原表位簇，其中有多个半胱氨酸，如位点121、124、137、139和149，这些半胱氨酸之间的相互作用形成抗原构象的重要因素，其中139～147位aa是主要的B细胞表位，160～169位aa是Th细胞表位。我国目前应用的乙肝疫苗，是由转化S基因质粒的酵母表达的主蛋白，免疫原包含外膜蛋白的B细胞表位和Th细胞表位，不能保护由于S基因变异毒株的感染^[11]。本研究疑似新发病例中HBV主蛋白抗原MHR aa总变异率为4.87%，T126I变异率最高，为8.64%，半胱氨酸位点未发现变异。MHR区变异株总流行率为49.38%（40/81），C基因型MHR变异株流行率为47.14%（33/70），与以往报道我国北方地区C基因型MHR变异株流行率（46.6%）一致^[13]。ALT检测结果正常组（＜43 IU/L）MHR变异株流行率显著高于异常组（≥43 IU/L），可能由于病毒变异，与临床症状不明显的HBV隐匿性感染有关^[11]。但由于本文ALT检测结果异常组（≥43 IU/L）样本量较少，还需进一步研究。