耐药警戒线调查是通过在已开展抗病毒治疗的 地区对未接受抗病毒治疗的HIV感染者进行耐药检 测，判断耐药株的传播水平^[1]。德宏州为云南省艾 滋病高流行地区之一，截至2011年底，德宏州累计 报告HIV/AIDS超过15000人，占云南省的16.7%； 累计抗病毒治疗4137人，占云南省的17.9%。为评 价德宏州HIV-1基因型及耐药株的流行情况，保证 抗病毒治疗的科学性和可持续性，本研究对2012年 德宏州HIV-1基因型及耐药传播水平进行调查。 对象与方法

1. 研究对象：按照《全国艾滋病病毒耐药性监测 指南》耐药警戒线调查的要求，2012年1－8月在云 南省德宏州连续收集16～25岁HIV新发现感染者 血浆样本，排除不满足要求的样本后获得60份血浆 样本。排除标准：①既往有HIV阳性检测记录；②既 往接受过抗病毒治疗；③有WHO提出的Ⅲ期或Ⅳ 期临床症状；④CD4＋T淋巴细胞计数＜200cell/μl。 调查对象均签署知情同意书。

2.检测方法：

（1）HIV-1RNA的提取：使用德国Qiagen公司 QIAamp Viral RNA试剂盒，根据标准操作程序从 140μl样本中提取HIV RNA。

（2）巢式PCR扩增pol基因区：使用TaKaRa公司 One Step RNA PCR试剂盒（AMV），进行反转录及 第1轮PCR扩增，反应总体系25μl，引物为MAW26 和RT21（表 1）。使 用 天 根 公 司2×Taq PCR MasterMix试剂盒，进行第2轮PCR扩增，反应体系 50μl，引物为PRO-l和RT20（表 1）。扩增产物长度 为1.3kb，包括蛋白酶（PR）基因全长（1～99密码子） 和反转录酶（RT）基因1～300密码子。

（3）PCR扩增产物电泳测序：使用1%琼脂糖凝 胶电泳观察PCR产物条带，阳性样本送北京梓熙生 物科技公司纯化和测序。采用3个正向测序引物 PROS3、RTAS、RTB和2个反向测序引物PROC1S、 RT20S3（表 1）。

表 1 HIV-1扩增及测序引物

表选项

3. 序 列 分 析：使 用Gene Codes公 司 的 Sequencher5.0软件进行序列拼接，Bioedit软件进行 多序列比对和序列整理。使用Mega5.1软件采用邻 接法构建系统进化树，重复运算1000次进行分型验 证。所得序列利用HIV耐药数据库（hivdb.stanford. edu）的 校 正 群 体 耐 药 分 析 工 具[the calibrated population resistance（CPR）tool]在线贴网分析^[2]， 参 照2009版 监 测 相 关 的 耐 药 突 变（Surveillance Drug Resistance Mutations，SDRM）列表^[3]，确定耐药 突变位点和对各种抗病毒药物的耐受程度。

4. HIV-1耐药株传播水平分析：根据WHO的 HIV耐药警戒线调查方案，采用截断顺序抽样法 （TSS）进行抽样^[1]，并结合“耐药警戒线监测抽样表” 进行耐药株传播水平分析。传播水平分为低传播水 平（＜5%）、中度传播水平（5%～15%）和高度传播水 平（＞15%）。

5. 统计学分析：应用SPSS19.0软件进行统计学 分析，率的比较采用χ 2检验。出现理论频数＜5时， 采用Fisher精确χ 2检验。 结 果

1. PCR扩增及测序：60份新报告的HIV感染者 血样经扩增和测序，52份样品获得可分析的pol区序 列，满足耐药警戒线统计分析的要求。52例感染者 中，男女性比例为1.26∶ 1，年龄17～25岁，M＝22 （P25＝20，P75＝23）岁。传播途径分布为异性传播为 主，占61.5%（32/52），静脉注射吸毒传播占30.8% （16/52），同性传播占7.7%（4/52）；异性传播中， 81.3%（26/32）有非婚异性性接触史，18.7%（6/32）是 由阳性配偶/固定性伴感染。民族以汉族（46.2%， 24/52）、傣族（26.9%，14/52）和景颇族（21.2%，11/52） 为主，其他民族占5.8%（3/52）。职业以农民为主 （73.1%，38/52），其他职业占26.9%。52例感染者中， 中国籍占59.6%（31/52），缅甸籍占40.4%（21/52）。其 中缅甸籍感染者中61.9%（13/21）为强制/劳教戒毒人 员，14.3%（3/21）为检测咨询者，14.3%（3/21）为孕产 期检查，4.8%（1/21）为术前检查，4.8%（1/21）为其 他。中国籍感染者主要感染途径为异性传播，缅甸 籍感染者主要为注射吸毒传播（表 2）。

表 2 德宏州52例不同国籍HIV-1感染者感染途径分布

表选项

2. 基因型分布：利用pol区序列进行分型，其中 URF占38.5%（20/52），C亚 型 占34.6%（18/52）， CRF01_AE占21.2%（11/52），CRF08_BC占3.8% （2/52）和B亚型占1.9%（1/52）。检测到的URF包括 BC重组（80.0%，16/20）和C/CRF01_AE重组（20.0%，4/20）。研究对象基因型在异性传播和注射毒品传 播间差异无统计学意义，在中国和缅甸籍感染者间 差异无统计学意义（表 3）。

表 3 2012年德宏州HIV-1感染者基因型分布

表选项

3. 耐药相关突变和耐药株流行率：52份样本 中，有2份检测到各携带1个针对非核苷类反转录酶 抑 制 剂（NNRTI）的 耐 药 传 播 相 关 突 变 位 点 （SDRM），分别为K103N和Y181I。根据耐药警戒 线调查的统计方法，将获得的序列按采样时间排序， 第9和第23个序列携带SDRM，计算累计耐药样本 数并填入《耐药警戒线监测抽样表》中，达到最大样 本量47时，停止抽样，此时耐药样本累计数（2）介于 上下限之间，属HIV-1耐药株的中度流行水平 （5%～15%），见表 4、5。

表 4 2012年德宏州HIV-1感染者耐药株特征

表选项

表 5 耐药传播警戒线调查的抽样方法和传播水平划分方法

表选项

抗病毒治疗人群的耐药监测能够揭示HIV耐药 发生、发展趋势以及影响因素。而新近感染人群的 耐药监测，可提供HIV耐药株分布和流行的情况，为 制定减少HIV耐药株传播的措施提供科学依据，指 导制定一线抗病毒治疗方案。但在实际中确定新近 感染相对比较复杂，需要结合流行病学资料和新近感染的检测来进行判断。为了满足耐药传播监测的 需要，WHO提出了耐药警戒线调查的方法，这是一 个资源最小化的监测方法，主要是将新发现的低年 龄组感染者近似地作为新近感染人 群，因为其可能暴露于HIV的年限 较短^[1]。

德宏州是云南省艾滋病流行时 间最长，抗病毒治疗规模较大的地 区，其耐药传播情况需要连续关注 和研究。近年来，德宏州的HIV疫 情出现一些新的变化趋势。2010 年德宏州筛查202089人次，新报告 感染者1282人，其中外籍366人， 占28.5%；2011年筛查483214人 次，新报告感染者1525人，其中外 籍595人，占39.0%；2012年筛查 711347人次，新报告感染者1341 人，其中外籍661人，占49.3%。可 见新发现感染者中外籍的构成比例 在加大，本次调查中缅甸籍的感染者占40.4%，提示跨境人口的艾滋病传播已经是一 个很突出的问题。从感染途径来看，异性传播已成 主要的感染途径，但中国籍和缅甸籍HIV感染者的 感染途径存在差异，中国籍主要为异性传播，而缅甸 籍主要为注射吸毒传播。

耐药警戒线所抽取的样本是一个近似的HIV新 近感染样本，其基因型分析能够提示HIV分子流行 病学的实时变化。在德宏州既往的调查中，C亚型 和URF分别占第一、二位^[4]。而在本调查中，URF已 经上升到了第一位，表明当地不但存在着复杂的病 毒基因重组，有的重组可能已开始传播。从总体上 来说，HIV基因型在异性传播和注射毒品传播之间 的差异无统计学意义，在不同国籍感染者之间的差 异无统计学意义。

本次调查检测到2个针对NNTRI的耐药突变位 点：K103N和Y181I。根据2008年德宏州的一项调 查，抗病毒治疗＞1年病毒载量超过1000copy/ml 的 患 者 中，K103N的 检 出 率 达39%（27/69），居 NNRTIs耐药突变位点首位^[5]。在2011年德宏州的 耐药监测中，已发现K103N传播的情况^[6]。与此相 反，Y181I在之前的耐药监测中均未报道^{[5, 7]}，并从1 名缅甸籍的IDU中检测到，提示耐药突变可能不是 来源于本地治疗人群。由于中缅两国在疫情的流行 特点和感染者的管理模式上存在差异，防止耐药株 的跨境传播应引起重视。

目前，德宏州HIV-1的主要传播途径已经由早 期的注射毒品转变为性传播，但本次调查中发现的 2例耐药毒株均为注射毒品传播。以往的调查发现 注射吸毒人群服药依从性较其他人群差^{[8, 9]}，提示该 人群产生耐药的可能性较大，加上德宏州注射毒品 传播时间较长，积累的原发性耐药比较容易通过注 射吸毒途径传播到新近感染人群中。为了证实这种 推测需要加强对治疗人群的耐药监测。

根据警戒线的判别方法，德宏州2011年耐药株 为低度流行水平（＜5%）^[6]，本次调查提示德宏州耐 药株的流行率已属于中度水平。从该地区对治疗 艾滋病患者耐药发生的监测情况来看，HIV病毒载 量＞1000copy/ml的艾滋病患者中HIV耐药株检出 率较高^[7]。因此当前控制耐药株传播的关键，是进 一步加强抗病毒治疗人群的规范治疗及科学管理， 同时通过有效的干预来降低危险行为，减少新发感 染。为全面了解耐药传播的情况，还需要开展连续 耐药监测。