木霉菌(Trichoderma spp)是土壤和植物根际生态中资源丰富的真菌，能够分泌多种细胞壁降解酶，拮抗植物病原真菌，促进植物的生长，具有重要生防和工业应用价值^{[1, 2, 3, 4]}。其中以里氏木霉为代表的工业用产酶菌株和以深绿木霉为代表的农业用生防菌株最受关注。基因敲除技术是理解木霉菌重要生防功能基因的有效途径之一，目前在里氏木霉菌中较成功的基因敲除技术包括原生质体、PEG/CaCl₂、基因枪等转化方法。而深绿木霉因其细胞壁厚，所以上述方法转化效率较低，筛选工作量大。因此探索高效率的遗传转化方法，对解释深绿木霉生防机制至关重要。根癌农杆菌介导的遗传转化(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation,ATMT) 是植物研究领域常用的方法。1995年，Bundock等^[5]首次成功进行了根癌农杆菌介导的酵母菌遗传转化；1998年，De Groot等^[6]首次利用ATMT法对6种丝状真菌(包括里氏木霉Trichoderma reesei)进行了转化，并获得了成功。此后，ATMT因其操作简便、转化效率高、遗传稳定、转基因低拷贝以及能够转化大片段DNA等优点，广泛地应用于丝状真菌的遗传转化中。

ATMT的转化效率受多个因素影响，如环境条件pH、温度、诱导剂浓度等影响。研究发现，培养基较低pH值有利于丝状真菌的转化，当pH为5.3时有助于哈茨木霉遗传转化，pH高于6.5之后几乎没有任何转化子形成，这可能与高pH不利于毒性蛋白的表达有关^[7]。Michielse研究转化温度对农杆菌转化效率的影响，结果表明：共转化温度在20~37℃这个范围内时，最适合农杆菌转化的温度是22~25℃^[8]。乙酰丁香酮(AS)可诱导毒性基因表达，因此在转化过程的共培养和诱导过程中起关键作用^[9]。共培养中缺少AS会导致无转化子的产生，而诱导过程中缺失AS则会引起转化效率下降^[10]。Leclerque等的研究发现AS的浓度达到200μmol/L时，可以增加转化子的数目，达到很高的转化效率^[11]。共培养时间依赖不同丝状真菌细胞壁结构、产孢时间以及胞内酶环境。此外，根癌农杆菌类型、受体菌株类型等内源因素对转化效率也有显著影响。

本研究旨在对ATMT转化中关键因子进行优化，成功构建深绿木霉菌碳代谢抑制子cre1基因敲除株，为进一步研究此基因的生防特性奠定基础。

深绿木霉菌(T. atroviride)T23，大肠杆菌DH5α菌株，农杆菌AGL-1菌株均为上海交通大学木霉菌种资源保藏中心提供。敲除载体质粒p1300qh由浙江大学农学院生物技术所林福呈教授惠赠。实验所用引物均由上海生工生物有限公司合成，引物序列及酶切位点如表1所示。

培养基和PDB培养基(不加琼脂粉)分别用于木霉菌固体培养和液体发酵；LB培养基用于大肠杆菌和农杆菌培养；IM培养基用于ATMT转化中诱导共培养及筛选^[12]。实验中涉及的卡那霉素、利福平、头孢霉素、潮霉素等抗生素溶液均配制成50 mg/ml母液，用0.22 μm滤器过滤除菌后，小管分装后－20 ℃保存备用。

植物基因组DNA提取试剂盒、DNA纯化回收试剂盒、质粒小提试剂盒购于天根生化科技有限公司。限制性内切酶及T4连接酶购于Fermentas公司；一般PCR用Premix Taq购于大连宝生物工程公司。氨苄青霉素、卡那霉素、潮霉素B及头孢等抗生素及MES、乙酰丁香酮等试剂均购于上海前尘生物技术有限公司。

提取方法参考里氏木霉常用基因组DNA提取方法^[13]。

以全基因组DNA为模板，用引物pcre1-F,pcre1-R和引物dcre1-F,dcre1-R分别扩增cre1基因上下游侧翼序列，PCR反应体系：PCR反应体25μl，包括基因组模板1μl，premix Taq 12.5μl，上下游引物各1μl，最后加灭菌ddH₂O补足至25μl。PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃终延伸10min；4℃储存。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。将PCR产物胶回收纯化获得cre1基因上下游侧翼序列cre1-up和cre1-down。

将cre1基因侧翼序列cre1-up和cre1-down两个片段分别酶切和酶连到基因敲除质粒p1300qh的潮霉素标记两侧的多克隆位点，构建cre1基因敲除突变株。将cre1基因上游侧翼序列和载体质粒p1300qh分别用HindIII和PstI限制性内切酶酶切上游片段cre1-up，纯化，T4连接酶连接酶切产物，构建p1300qh∷cre1-up∷hyg重组片段，转化到大肠杆菌DH5α，菌落PCR验证后液体培养提取质粒验证。用同样的方法将cre1-down片段用限制性内切酶Kpn I 和EcoR I酶切，纯化后经T4连接酶将该片段导入含上游片段载体的下游多克隆位点，形成cre1基因敲除框p1300qh∷cre1-up∷hyg∷cre1-down。

ATMT转化方法主要参考了ATMT转化的经典方法^[14]和金欣等^[15]在里氏木霉中进行遗传改造的方法，对于ATMT转化过程中的诱导和筛选过程稍作改动。将选择性PDA培养基替换为含200μg/ml潮霉素和300 μg/ml头孢霉素的IM培养基。在选择性培养基上培养4~5天后，开始挑选可能的转化子到选择性PDA培养基(含300 μg/ml的头孢与200 μg/ml的潮霉素)，验证后在含300 μg/ml头孢的PDA平板上传3代后，单孢分离再传一代后用含潮霉素的平板验证。

设计两对引物，分别筛选T-DNA(tDNA-F/Hph-R)和同源重组的转化子(Δcre1-F/Δcre1-F)，如图1所示。在T-DNA的上游多克隆位点，即5′同源臂的上方设计一个上游引物tDNA-F，在抗性筛选标记潮霉素基因编码框序列中设计下游引物Hph-R，PCR扩增包含上游同源臂和部分潮霉素基因的片段，如果电泳结果有条带，则表明该转化子中包含T-DNA随机插入的情况。另一对引物的设计则以双交换后的DNA序列为模板，在cre1基因5′同源臂的上游设计上游引物Δcre1-F，在潮霉素编码框序列中设计下游引物Δcre1-R，PCR扩增包含上游同源臂和部分潮霉素抗性基因的交换片段，上游引物一般能与基因组DNA结合，但只有发生了同源双交换，下游引物才能结合到潮霉素编码框序列，才能扩增得到长度正确的DNA片段，因此将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳后长度正确的条带则表明该转化子发生了同源重组，若上述两种PCR产物琼脂糖凝胶电泳均显示有长度正确的条带，则表明该转化子在发生同源重组的同时还存在单拷贝甚至多拷贝的T-DNA插入的情况。

图 1 ATMT转化原理及筛选引物设计 Fig. 1 Mechanism of ATMT and primers design for screening

图选项

提取深绿木霉菌DNA，根据http://genome.jgi-psf.org/Triat2/Triat2.home.html中深绿木霉全基因组序列，比对获得深绿木霉cre1基因及其侧翼序列，设计引物cre1-F和cre1-R，PCR扩增cre1基因上下游侧翼序列，扩增的上游片段和下游片段长度分别为711bp和843bp，如图2a所示。根据敲除载体构建方法(图3)，将两个片段分别连接到pC1300qh质粒载体的多克隆位点，经转化，挑取阳性克隆，PCR(图2b)和双酶切验证(图2c)，结果均正确无误。成功将cre1上下游侧翼序列导入到pC1300qh载体，形成敲除载体pC1300qhsilent-cre1。

图 2 实验涉及电泳图 Fig. 2 Electrophoretograms related in this research (a) Amplification of cre1 flanking sequences M:Marker2000; 1:cre1-up; 2:cre1-down; 3: cre1-up∷hyg∷cre1-down (b) Verification of positive clone for plasmid p1300qhsilent-cre1 after Escherichia coli transformation (c) Verification of plasmid p1300qhsilent-cre1 by double digestion 1: Hind III and Pst I; 2: Kpn I and EcoR I; 3: Hind III and EcoR I

图选项

图 3 敲除载体p1300qhsilent-cre1构建示意 Fig. 3 The construction of knock out vector pC1300qhsilent-cre1 RB: Right border of TDNA; cre1-up:5′ flanking frame of cre1;Hyg cassette: hygromycin expression cassette in fungi; cre1-down: 3′ flanking frame of cre1; LB：Left border of TDNA

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诱导时间是影响ATMT转化效率的关键因子，针对不同受体细胞特点，诱导时间存在较大差异^[16]。如在木霉菌中，里氏木霉、哈茨木霉等孢子壁较薄，诱导时间相对较短，而深绿木霉孢子壁厚，农杆菌毒性蛋白作用时间延长，或者是T-DNA在深绿木霉细胞中存在形式中有效重组的形式较少^[17]，引起效率下降，因此必须提供较长的诱导时间，才有可能获得转化子。深绿木霉在IM培养基中由于营养贫瘠，产孢较快。孢子的产生又抑制ATMT转化。

为了克服上述因素条件对转化效率的抑制，我们着重优化了ATMT转化的实验流程(图4)。在前期诱导共培养时，在IM培养基(加40mol/L MES及200mmol/L AS)中放入玻璃纸，再在玻璃纸上均匀涂布农杆菌和木霉菌孢悬液的等体积混合液，于25℃培养箱共培养36h左右，待白色菌丝铺满玻璃纸表面而未产孢的临界时期将玻璃纸转移至选择性培养基。传统的选择性培养基由CYA培养基或PDA加抗生素组成，不含诱导剂，因此在筛选过程中不产生诱导作用，而转化诱导时间仅36h，对深绿木霉而言，诱导时间不足，将引起 ATMT转化效率下降，平板中几乎没有转化子产生。按照传统的方法20个平板平均筛选到1~2个转化子，大多数时候没有转化子产生，且产生的转化子大多为T-DNA插入，同源双交换发生几率极低。

图 4 ATMT转化过程优化 Fig. 4 Advancement of ATMT processing

图选项

我们将传统选择性培养基优化为IM培养基，并加入相应浓度的筛选用的抗生素，诱导剂与抗生素同时作用，边诱导边筛选，抗生素的存在避免了孢子形成，而诱导剂起效又提升了诱导时间，转化子长出较多(图5)，一般每个平板长0.8~1个，大大提升了转化效率。用改进后的ATMT转化方法，一般只需要10个平板，便可以筛选到8~10个转化子，而且同源双交换的转化子发生几率提高(表2)。

图 5 改进后ATMT转化子在筛选平板中生长状态 Fig. 5 Growing status of transformants on selective plates by ATMT

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含有敲除载体p1300qhsilent-cre1的农杆菌和深绿木霉T23野生型的孢子共培养2天后。选择不同木霉菌孢子浓度，比较了三个木霉菌孢子浓度1×10⁶，2×10⁶，4×10⁶，6×10⁶，8×10⁶，1×10⁷六个梯度条件下，用IM培养基加抗生素筛选ATMT转化子。将筛选培养基置于25℃培养箱培养10天左右，一般培养4~5天，第一批转化子出现，在其后的5~10天中还会陆续出现更多的转化子。结果表明(图6)：当木霉菌分生孢子浓度为8×10⁶时，转化效率较高，且同源重组的转化子出现几率较大。

图 6 不同分生孢子浓度下ATMT转化得到的转化子数 Fig. 6 The number of transformants after ATMT under different spore concentrations

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利用改良的ATMT方法，我们成功构建了深绿木霉Δcre1敲除株，比较了二者生长和产孢情况。如图7和图8所示，与野生株相比，cre1基因突变后，菌丝生长缓慢，菌丝细腻密集，气生菌丝偏少，产孢量下降。cre1是木霉菌细胞内全局性的碳代谢调控因子^[18]，尤其是当葡萄糖存在的条件下，cre1基因调控其各种碳代谢酶类，能够抑制分解其他碳源的水解酶类如几丁质酶、纤维素酶等，从而使细胞优先利用较易代谢的葡萄糖而不是其他能量代价更好的碳源^[19]。葡萄糖存在条件下，野生菌株中cre1基因首先利用葡萄糖代谢生长，而缺失cre1基因的敲除株则减弱了葡萄糖代谢的能力，表现为生长缓慢，菌丝形态纤细和密集性。再次印证了改良的ATMT在深绿木霉中敲除基因的可行性。

图 7 培养5天后突变株和野生株平板生长情况比较 Fig. 7 Compare of cre1 mutant strain and wild type when cultivated on PDA for 5 days

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图 8 cre1突变株和野生株平板生长速率 Fig. 8 Growth rates of cre1 mutant strain and wild type on PDA plates

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传统的转化方法在深绿木霉转化效率很低，得到转化子极少且不稳定。本研究以深绿木霉碳代谢抑制因子cre1为靶标，对ATMT转化方式进行了优化，改进筛选培养基成分，增加了木霉菌分生孢子浓度，延长了诱导剂作用时间，提升了转化效率及同源双交换发生几率。

改良后的方法适用于细胞壁较厚的深绿木霉，一方面木霉菌孢子浓度从1×10⁶提升到8×10⁶，另一方面，在保持诱导剂AS浓度不变的情况下，适当增加诱导培养的时间，从传统的36h延长到诱导时间无限制，边诱导边筛选。改变筛选培养基，200μMAS的IM培养基，同时加上200 μg/ml 的潮霉素进行抗性筛选，辅以300 μg/ml的特美汀抑制农杆菌的生长。改进方法减少农杆菌在侵染过程中阻力，增加其侵染效率，提高转化效率及转化子的稳定性。经筛选鉴定，在10个阳性的转化子中，经鉴定1个是同源重组，9个是T-DNA插入，成功构建了深绿木霉Δcre1敲除株。

此外，我们还利用此方法对深绿木霉velvet蛋白基因vel进行敲除，共进行了1次ATMT转化，10个平板，获得8个转化子，1个同源重组，7个为T-DNA插入，证明此方法高效，可靠。目前正尝试将此方法在其他生防木霉菌属中应用，希望此方法可对木霉菌-植物-病菌三方互作调控方面的研究提供技术支持。