哺乳动物肝脏在损伤后具有很强的再生能力，肝脏再生是一个复杂的过程，许多基因和细胞因子(如HGF、EGF、IL-6、TNF-α等)以不同的作用机制参与调节肝脏再生，但是这些细胞因子均缺乏特异性。1975年，LaBreque等^[1]首次从肝脏中发现能特异性刺激肝细胞增殖的物质，即肝刺激物(hepatic stimulator substance,HSS)，但是HSS是一种蛋白混合物，其有效活性成份至今未得到完全阐明。HPPCn(Hepatopoietin Cn)最早是从新生小牛肝脏HSS中分离纯化的一种分子量为30kDa、具有特异性肝刺激活性的蛋白质因子^[2]。序列分析结果显示，HPPCn与磷蛋白32(phosphoprotein 32,pp32)具有很高的同源性，两者同属于富含亮氨酸酸性核磷蛋白(acidic leucine-rich nuclear phosphoprotein 32,ANP32)家族。ANP32家族成员是一类热稳定蛋白，包含典型氨基端的富亮氨酸重复序列和羧基端的酸性尾巴，在正常组织中可自我更新的细胞以及部分肿瘤组织中表达水平较高，并参与小脑的形态学发育、细胞骨架动力学、细胞形态学、蛋白质降解以及细胞信号转导等多种生物学过程^{[3, 4]}。

为了研究HPPCn的生物学功能，我们前期构建了PET-24a(+)/HPPCn重组表达载体^[5]，但通过该系统诱导表达的人HPPCn重组蛋白以包涵体形式为主，因目的蛋白纯化需要经过变性与复性等步骤，不仅操作过程繁琐，而且可能影响到蛋白活性。为优化表达条件，本研究采用了一种新的冷休克表达系统，通过无缝克隆(Seamless)技术将人HPPCn基因插入原核表达载体pColdⅡ，最终成功获得可溶性表达的人HPPCn重组蛋白，简化了纯化过程，且目的蛋白具有较高的生物学活性。

人HPPCn重组质粒PET-24a(+)/HPPCn为本室保存，原核表达载体pColdⅡ及限制性内切酶NdeⅠ、HindⅢ 购自TaKaRa公司，大肠杆菌感受态细胞DH5α、BL21(DE3)和转有PG-TF2分子伴侣质粒的菌种BL21(DE3)购自天根生物工程公司。

PCR产物回收试剂盒购自Promega公司；NovoRec PCR一步定向克隆试剂盒购自Novoprotein公司；IPTG、Brdu试剂购自Sigma公司；镍离子纯化柱购自GE公司；咪唑购自USB；抗人HPPCn单克隆抗体由本室保存；Brdu及PCNA单克隆抗体、山羊抗小鼠IgG/辣根酶标记的二抗购自中杉金桥公司。

人肝癌细胞系SMMC7721在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基、5%CO₂、37℃、饱和湿度下常规培养。

PCR扩增引物序列为：上游引物5′-CATCATCATCATCATCATATGGAGATGGGCAGAC-3′(下划线为NdeⅠ酶切位点)；下游引物5′-AGACTGCAGGTCGACAAGCTTTTAGTCATCATCTTC-3′(下划线为HindⅢ酶切位点)。在设计引物时，按照无缝克隆技术要求在上下游引物的5′端加上与线性化载体两端一致的15个碱基序列，保证载体末端与扩增目的DNA片段末端具有至少15个同源碱基序列。PCR反应模板为PET-24a(+)/HPPCn，反应条件为94℃预变性5min，94℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸50s，共28个循环，最终再72℃延伸5min。PCR反应完成后进行普通琼脂糖凝胶电泳，切胶、纯化回收。

重组基因的克隆方法采用无缝克隆技术，首先由NdeⅠ和HindⅢ双酶切得到pColdⅡ线性化载体，将HPPCn片段和线性化载体以5∶1的摩尔比加入到离心管中进行重组反应，加入高保真聚合酶，混匀后37℃放置20min。载体链接完成后，转化大肠杆菌DH5α，涂于含有50μg/ml氨苄霉素的LB琼脂平板上，37℃培养过夜。挑取单个菌落，PCR方法筛选阳性克隆，提取质粒并测序。

将pColdⅡ/HPPCn重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，37℃震荡培养过夜后按1∶100比例接种于含有氨苄霉素的LB培养基，摇菌至OD₆₀₀为0.6。根据诱导条件不同分为4组：(1)0.5mmol/L IPTG37℃诱导3h；(2)0.1mmol/L IPTG 16℃诱导过夜；(3)5ng/ml的四环素诱导分子伴侣质粒pG-TF2表达30min后，0.5mmol/L IPTG 37℃诱导3h；(4)5ng/ml的四环素诱导分子伴侣质粒pG-TF2表达30min后，0.1mmol/L IPTG 16℃诱导过夜。然后分别收集菌体，菌体沉淀重悬于PMSF终浓度为0.1mmol/L的磷酸盐缓冲液(pH 7.8)中。超声破碎菌体，超4s，停4s，至菌体溶液半透明，采集不同诱导时间点菌液及超声后样本进行12%SDS-PAGE凝胶电泳，考马斯亮蓝G250染色分析。

蛋白纯化条件根据镍离子亲和柱HisTrap FF Crude进行，即ddH₂0洗5cv，磷酸盐缓冲液平衡10cv，蛋白上样后用含500mmol/L咪唑的洗脱缓冲液洗脱10cv，12% SDS-PAGE凝胶电泳检测目的蛋白，Image Quant TL软件分析蛋白纯度，Western blot方法对目的蛋白鉴定，条件为4℃、110V恒压转膜70min，10%脱脂牛奶室温摇床封闭2h，然后加入以封闭液1∶1 000稀释的抗人HPPCn单克隆抗体，4℃孵育过夜。加入HRP标记的山羊抗小鼠二抗(稀释比例1∶5 000)孵育后，ECL方法检测，Image Quant LAS4000扫描分析图像。

取SMMC7721对数生长期细胞按5×10³/孔接种于96孔培养板，37℃，5%CO₂培养，待细胞贴壁后，加入不同浓度的HPPCn(0、10、100ng/ml)蛋白，每种浓度设置3个复孔，刺激作用48h，4%多聚甲醛固定细胞前2h掺入终浓度为10μmol/L的Brdu，0.5%TritonX-100冰上打孔20min，3%H₂O₂去除内源性过氧化物酶10min，2mol/L HCl变性掺入Brdu组30min，10%FBS封闭2h，分别加入以封闭液稀释的Brdu和PCNA单克隆抗体，4℃过夜，次日加入HRP标记的二抗，显微镜下DAB显色。

PCR方法从PET-24a(+)/HPPCn扩增目的基因，扩增产物大小为777bp的基因片段，重组质粒链接完成后，转化大肠杆菌DH5α，挑选12个单克隆菌进行PCR鉴定，克隆阳性率达100%，如图 1。挑选其中2个克隆测序鉴定，目的基因序列完全正确。

图 1 pColdⅡ/HPPCn重组质粒的构建 Fig. 1 Construction of recombinant plasmid pCold/HPPCn 1: PCR amplification product of human HPPCn gene; 2~13: PCR identification of monoclonal bacteria; M: DNA plus Marker DL2000

图选项

提取鉴定正确的pColdⅡ/HPPCn重组质粒，转化大肠杆菌表达菌种，对目的蛋白诱导条件筛选优化，观察不同诱导温度、分子伴侣的有无、IPTG终浓度及诱导时间对目的蛋白表达量的影响。SDS-PAGE凝胶电泳结果显示不同条件下诱导表达的HPPCn重组蛋白(图 2中箭头所指)在超声后上清中的含量均明显高于超声沉淀，表明目的蛋白HPPCn在新构建的冷休克表达系统中为可溶性表达。电泳结果显示，低温(16℃)可促进目的蛋白表达增加，而分子伴侣存在与否对目的蛋白表达量无明显影响。最终确定表达菌种为BL21(DE3)，诱导表达温度为16℃，IPTG终浓度0.1mmol/L条件下诱导过夜为最适诱导条件。

图 2 人HPPCn重组蛋白可溶性表达的条件优化 Fig. 2 Conditional optimization of soluble expression of human HPPCn recombinant protein (a) 0.5mmol/L IPTG, incubate for 3h at 37℃ (b) 0.1mmol/L IPTG, incubate for overnight at 16℃ (c) 0.5mmol/L IPTG after 5ng/ml Tetracycline 0.5h, then incubate for 3h at 37℃ (d) 0.1mmol/L IPTG after 5ng/ml Tetracycline 0.5h, then incubate for overnight at 16℃ In the four groups, 1~4, and 6: The whole bacterial lysate of IPTG induced; 5: The whole bacterial lysate without IPTG induced; 7: Supernatant of the lysate with IPTG induced; 8: Precipitation of the lysate with IPTG induced; M: Protein marker

图选项

采用镍离子亲和层析柱纯化后的人HPPCn重组蛋白纯度达到94.88%，纯化结果如图 3所示。Western blot鉴定结果显示纯化后的目的蛋白能够被HPPCn特异性抗体识别，如图 4。

图 3 HPPCn诱导表达纯化结果 Fig. 3 Purification of HPPCn 1: Pro-induced; 2: Post-induced; 3: Precipitation of the lysate; 4: Supernatant of the lysate; 5: Flowing after affinity; 6: Purified HPPCn; M: Protein marker

图选项

图 4 HPPCn的Western blot鉴定 Fig. 4 Identification of HPPCn by Western blot 1: The band of identification by Western blot; M: Protein marker

图选项

不同浓度人HPPCn重组蛋白(0、10、100ng/ml)刺激SMMC7721细胞，Brdu掺入实验结果显示，HPPCn刺激SMMC7721细胞核中Brdu掺入增加，提示HPPCn可促进SMMC7721细胞DNA合成；同时，随着HPPCn浓度增加，SMMC7721细胞PCNA表达增加，提示HPPCn可促进SMMC7721细胞增殖，且Brdu掺入及PCNA表达水平的变化与人HPPCn重组蛋白浓度呈量效关系，如图 5。

图 5 人HPPCn重组蛋白对SMMC7721细胞增殖的影响 Fig. 5 Effects of human HPPCn recombinant protein on the proliferation of SMMC7721 cells (100×) (a) HPPCn 0ng/ml (b) HPPCn 10ng/ml (c) HPPCn 100ng/ml

图选项

以大肠杆菌为表达载体的原核表达系统是最早采用的表达系统，该系统不仅能够在较短时间内获得基因表达产物，而且大肠杆菌遗传背景清楚、生长速度快、成本低廉、可以大规模生产目的蛋白。目的基因在大肠杆菌中的表达形式一般为包涵体表达、可溶性表达和分泌型表达，当重组蛋白在大肠杆菌中过量表达时，往往因肽链折叠时产生错误聚合，形成一种不溶性的包涵体颗粒^[6]。我们之前构建重组质粒PET-24a(+)/HPPCn，其表达产物就主要以包涵体的形式存在，因此在后续的分离纯化过程中往往需要用高浓度的尿素变性后再复性，这会影响蛋白活性，而且复性率、蛋白得率都不理想。

选择合适的表达系统是可溶性蛋白高效表达的前提，本实验为实现HPPCn蛋白的可溶性表达，我们应用冷休克表达载体pColdⅡ，经无缝克隆技术构建重组质粒。pColdⅡ表达载体的特点是利用冷休克基因cspA启动子设计的高效率蛋白质表达载体，cspA启动子的下游处，插入了lac操纵子，以便严格控制表达，当温度充分降低时，培养的大肠杆菌几乎暂时停止生长，大部分蛋白表达减少，而此时一组被称之为"冷休克蛋白"的蛋白质被特异性诱导表达。冷休克表达系统可应用于诱导蛋白的高水平表达^[7]，并可促进蛋白的可溶性。

无缝克隆技术是一种快速简单且高效的DNA定向克隆方法，不依赖于连接酶、补平末端等手段，可将一个或多个DNA片段精确地融合，而且不受载体和目的片段酶切位点的限制，不产生多余的核苷酸序列。该技术的原理是直接利用同源重组的方法，根据线性化载体两端的序列，PCR引物设计时在5′端加入与线性化载体的两端一致的15~20个碱基序列^[8]。重组时，只需在反应体系中加入无缝交换酶，目的基因即可与线性化载体两端的序列完成定向交换，从而实现目的片段与载体的连接，克隆阳性率可达90%以上^[9]。而传统克隆技术主要是限制性酶切消化和DNA连接反应，PCR产物需经酶切后才能连接产生融合基因，但是在连接的时候经常留下操纵子序列，这种非正常的序列可以改变DNA碱基和外源插入的氨基酸碱基之间的距离，进一步影响融合蛋白的结构和功能^[10]，而且传统方法均耗时费力，操作复杂且效率低下，难以满足高通量需求。

尽管本实验采用了冷休克表达载体及无缝克隆重组技术，并对诱导表达条件进行了优化，但是HPPCn蛋白可溶性表达的产量仍有提升空间。提高蛋白可溶性表达水平的一般策略有：(1)选择有利于外源性蛋白表达的宿主，构建促进二硫键形成的宿主^[11]；(2)重组蛋白与分子伴侣共表达，分子伴侣在细胞内帮助蛋白多肽分子间、分子内的正确组装，而且在组装完毕后与之分离，其本身并不构成功能蛋白的组成部分^[12]；(3)降低培养温度，选择合适的启动子，本研究中应用的cspA启动子，能在适当低温条件下提高蛋白的可溶性，是外源蛋白在低温诱导时的温度敏感型启动子^[13]；(4)诱导外源蛋白分泌表达，此过程是要把目的蛋白分泌到周质空间，周质空间氧化性的环境有利于二硫键的形成，并且在周质空间有折叠酶DsbA的存在，可以帮助蛋白正确折叠；(5)改变培养基的种类，选择合适的pH值等；(6)筛选诱导表达条件。本研究用冷休克表达载体构建了重组质粒pColdⅡ/HPPCn，当培养温度为16℃，终浓度为0.1mmol/L的IPTG过夜诱导时，人重组HPPCn蛋白在大肠杆菌中大量表达，而且是以可溶性蛋白形式表达。

我国是一个肝病大国，乙肝病毒携带者居全球首位，因而如果能够利用HPPCn深入研究肝再生的机制，开发治疗肝损伤的药物，将会有十分重要的意义。HPPCn是富含亮氨酸的酸性核蛋白，呈多细胞、多组织分布，在正常肝组织中表达量较低，在肝脏损伤时或者肝癌细胞中表达水平上调^[14]。体外实验显示，人HPPCn重组蛋白能刺激原代培养肝细胞和人肝癌细胞系的DNA合成^[2]。HPPCn不仅能够延缓肝纤维化，而且对CCL4和酒精引起的肝脏损伤具有保护作用^{[15, 16]}，HPPCn还可能参与肿瘤的发生^[17]。有研究显示大脑是表达HPPCn最丰富的器官，HPPCn在出生后不同时间脑组织中的含量具有显著差异，提示HPPCn可能参与哺乳动物中枢神经系统的发育^[18]，这就为治疗中枢神经系统疾病提供了新的思路。因此，通过本实验更容易地获得高纯度的具有生物活性的HPPCn具有十分重要的意义，可溶性表达人HPPCn重组蛋白的获得不仅为HPPCn生物学功能的深入研究提供基础性技术条件，而且为解决其他蛋白纯化中遇到的表达困难或者目的蛋白不可溶等问题提供较好的借鉴。

本研究运用冷休克表达载体pColdⅡ和无缝克隆技术成功获得了人HPPCn重组质粒，诱导HPPCn的可溶性表达，最终获得HPPCn纯度达到95%，并在SMMC7721细胞系上验证了其生物学活性，为后续HPPCn蛋白工业化生产和应用提供了可行性。