2020, Vol. 40 
补肾助孕颗粒处方为江苏省中医院国医大师夏桂成教授的经验方，由莵丝子、炒白芍、酒萸肉、丹参、淮山药、醋柴胡、鹿角片、紫石英8味药组成，具有使“阳长至重”，舒畅心肝气机，安定心肝魂魄的功效，临床上用于治疗肾虚偏阳、夹有肝郁型黄体功能不全性不孕症，应用多年，有长期临床经验[1-3]，且经过多个药理试验揭示疗效[4-6]。但目前尚无制剂批准文号，因此，对其进行医疗机构制剂及新药研究的药学研究，包括制备工艺及质量标准、稳定性试验等十分必要。中药指纹图谱是一种综合的、可量化的质量分析方法，能够较好地反映出中药制剂的整体质量，广泛应用于中药制剂质量控制[7-8]。为了更好地控制补肾助孕颗粒的制剂质量，本文采用HPLC法建立了特征图谱，并同时建立了外标法测定没食子酸、5-羟甲基糠醛、莫诺苷、当药苷、马钱苷、芍药苷、金丝桃苷、紫云英苷、迷迭香酸、丹酚酸B的含量。
1 仪器与试药 1.1 仪器Waters e2695HPLC高效液相色谱仪，Waters 2998PDA检测器；Sartorius BP-211D电子分析天平（赛多利斯公司）；SK6200H超声仪（上海科导超声仪器有限公司）。
1.2 试剂乙腈（Tedia，色谱纯），水为超纯水，其余试剂均为分析纯。
1.3 对照品及样品丹酚酸B、金丝桃苷、紫云英苷、莫诺苷、当药苷、迷迭香酸的对照品购于南京聚康医药化工有限公司（批号分别为160508、181025、180924、160928、181211、161110，质量分数均≥98%），没食子酸、马钱苷、芍药苷购于中国食品药品检定研究院（批号分别为110831-201204、111640-201005、110736-201337，计算浓度时浓度分别以89.9%、99.2%、94.9%折算），5-羟甲基糠醛购于南京宁岐医药有限公司（批号为130911，质量分数≥98%）。
丹参（批号20180101-01，产地贵州）、醋柴胡（批号20181002-01，产地陕西）均购于贵州同德药业有限公司，酒萸肉（批号190201，产地河南）、山药（批号190101，产地河南）均购于马鞍山井泉中药饮片有限公司，菟丝子（批号181101，产地内蒙）、紫石英（批号181101，产地江苏）均购于安徽井泉中药饮片股份有限公司，鹿角片（批号190101，产地吉林）购于安徽万生中药饮片有限公司，炒白芍（批号19010712，产地安徽）购于安徽协和成药业饮片有限公司，经过南京中医药大学附属医院周琴妹主任中药师鉴定，分别为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根和根茎，伞形科植物柴胡Bupleurum chinense DC.干燥根的炮制品，山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalis Sieb. et Zucc.的干燥成熟果肉的炮制品，薯蓣科植物薯蓣Dioscotea opposita Thunb.的干燥根茎，旋花科植物菟丝子Cuscuta chinesis Lam.的干燥成熟种子，主含氟化钙的氟化物类矿物荧石族荧石，鹿科动物马鹿Cervus elaphus Linnaeus已骨化的角，毛茛科植物芍药Paeonia lactiflora Pall.干燥根的炮制品。编号为S1~S15的15批补肾助孕颗粒均由江苏省中医院制剂部提供，批号分别为171011、171012、171015、171026、171027、171028、171203、171205、171208、171221、171225、180110、180112、180113、180320。各单味药水煎煮液以及其阴性制剂由实验室按制剂工艺自制。
2 方法与结果 2.1 溶液制备 2.1.1 混合对照品溶液分别精密称取没食子酸、5-羟甲基糠醛、莫诺苷、马钱苷、当药苷、芍药苷、金丝桃苷、紫云英苷、迷迭香酸、丹酚酸B的对照品适量，加甲醇制成浓度分别为0.540、1.600、0.637、0.225、0.623、1.053、0.638、0.480、0.365、0.877 mg·mL-1的混合溶液，用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。
2.1.2 供试品溶液取补肾助孕颗粒，研细，称取约0.8 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇水10 mL，密塞，称量，超声（200 W，40 kHz）处理30 min，放置至室温，再称量，用70%甲醇水补足减失的量，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
2.1.3 阴性样品溶液取酒萸肉、菟丝子、丹参、炒白芍和酒萸肉-炒白芍阴性样品，按“2.1.2”项下方法制备各阴性样品溶液，即得。
2.2 色谱条件采用Hedera ODS-2 C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈（A）-0.2%磷酸水溶液（B）为流动相，梯度洗脱（0~15 min，5%A→7%A；15~30 min，7%A→9.5%A；30~31 min，9.5%A→11%A；31~55 min，11%A；55~65 min，11%A→20%A；65~95 min，20%A→22%A；95~100 min，22%A→5%A），流速1.0 mL·min-1，检测波长237 nm，柱温30 ℃，进样量10 μL。吸取“2.1”项下的混合对照品溶液、供试品溶液以及分别缺酒萸肉、缺菟丝子、缺丹参、缺炒白芍、缺炒白芍和酒萸肉的各阴性样品溶液，分别按上述色谱条件进样，记录色谱图，结果在阴性样品溶液色谱图中的相应位置上无干扰峰出现，色谱图见图 1。
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1.没食子酸（gallic acid）2. 5-羟甲基糠醛（5-hydroxymethylfurfural）3.莫诺苷（morroniside）4.当药苷（sweroside）5.马钱苷（loganin）6.芍药苷（paeoniflorin）7.金丝桃苷（hyperoside）8.紫云英苷（astragaline）9.迷迭香酸（rosmarinic acid）10.丹酚酸B（salvianolic acid B） 图 1 混合对照品（A）、样品（B）、缺酒萸肉阴性样品（C）、缺菟丝子阴性样品（D）、缺丹参阴性样品（E）、缺炒白芍阴性样品（F）及缺酒萸肉-炒白芍阴性样品（G）的色谱图 Fig.1 HPLC chromatograms of mixed reference substances(A), Bushen Zhuyun granules(B), negative sample without wine-processed Corni Fructus(C), negative sample without Cuscutae Semen(D), negative sample without Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma(E), negative sample without fried Paeoniae Radix Alba(F)and negative sample without Corni Fructus and fried Paeoniae Radix Alba(G) |
称取编号为S1（批号171011）的补肾助孕颗粒0.8 g，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，精密吸取10 μL。按“2.2”项下色谱条件连续进样6次进行测定，记录峰面积。以分离度较好，峰面积大，为各批样品共有的莫诺苷峰为参照峰，计算各共有相对峰面积的RSD，结果均小于4.8%，说明仪器精密度良好。用中药色谱指纹图谱相似度评价软件（2004A版）进行分析，计算得色谱图之间的相似度为1.00，符合中药特征图谱的要求。
2.3.2 稳定性试验称取编号为S1（批号171011）的补肾助孕颗粒0.8 g，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，精密吸取10 μL，按“2.2”项下色谱条件，分别在0、2、4、8、12、24 h进样测定，记录峰面积。以莫诺苷峰为参照峰，计算各共有峰相对峰面积的RSD < 4.5%，供试品溶液在24 h内稳定。用中药色谱指纹图谱相似度评价软件（2004A版）进行分析，计算得色谱图之间的相似度为1.00，符合中药特征图谱的要求。
2.3.3 重复性试验称取编号为S1（批号171011）的补肾助孕颗粒0.8 g，平行6份，分别按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，精密吸取10 μL，按“2.2”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以莫诺苷峰为参照峰，计算各共有峰相对峰面积的RSD < 3.7%，表明该方法重复性良好。用中药色谱指纹图谱相似度评价软件（2004A版）进行分析，计算得色谱图之间的相似度为1.00，符合中药特征图谱的要求。
2.3.4 特征指纹图谱的建立按“2.1.2”项下方法制备编号为S1~S15的15批样品的供试品溶液，精密吸取10 μL，按照“2.2”项下色谱条件进样，记录色谱图，导入中药色谱指纹图谱相似度评价软件（2004A版）。选取S1样品的色谱图为参照图谱，生成补肾助孕颗粒的对照特征图谱，见图 2，15批补肾助孕颗粒的HPLC特征图谱匹配图见图 3。共确认23个共有峰，指认出10个色谱峰，以莫诺苷峰为参照峰，计算S1~S15号样品的特征图谱与对照特征图谱的相似度，结果分别为0.995、0.984、0.991、0.998、0.997、0.998、0.997、0.995、0.983、0.998、0.984、0.997、0.996、0.997、0.997，均大于0.98。
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2.没食子酸（gallic acid）3. 5-羟甲基糠醛（5-hydroxymethylfurfural）6.莫诺苷（morroniside）8.当药苷（sweroside）9.马钱苷（loganin）12.芍药苷（paeoniflorin）16.金丝桃苷（hyperoside）19.紫云英苷（astragaline）21.迷迭香酸（rosmarinic acid）23.丹酚酸B（salvianolic acid B） 图 2 补肾助孕颗粒的对照特征图谱 Fig.2 Reference characteristic chromatogram of Bushen Zhuyun granules |
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R.对照特征图谱（reference characteristic chromatogram） 图 3 15批补肾助孕颗粒特征图谱 Fig.3 The characteristic chromatograms of 15 batches of Bushen Zhuyun granules |
按“2.1.2”项下方法制备各单味饮片的供试溶液，精密吸取10 μL，按“2.2”项下色谱条件进样测定，结果见图 4~7。试验结果表明，部分共有峰在相应的饮片中能对应，1、2、3、4、5、6、8、9、20号峰为酒萸肉饮片中的成分；7、13、14、15、16、17、19号峰为菟丝子饮片中的成分；2、10、11、12、18号峰为炒白芍饮片中的成分；20、21、22、23号峰为丹参饮片中的成分。其中2号峰为酒萸肉和炒白芍共有的成分；20号峰为酒萸肉和菟丝子共有的成分。
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图 4 补肾助孕颗粒（S1）与酒萸肉饮片（S2）的图谱 Fig.4 The chromatograms of Bushen Zhuyun granules(S1)and wine-processed Corni Fructus(S2) |
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图 5 补肾助孕颗粒（S1）与菟丝子饮片（S2）的图谱 Fig.5 The chromatograms of Bushen Zhuyun granules(S1)and Cuscutae Semen(S2) |
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图 6 补肾助孕颗粒（S1）与丹参饮片（S2）的图谱 Fig.6 The chromatograms of Bushen Zhuyun granules(S1)and Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma(S2) |
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图 7 补肾助孕颗粒（S1）与炒白芍饮片（S2）的图谱 Fig.7 The chromatograms of Bushen Zhuyun granules(S1)and fried Paeoniae Radix Alba(S2) |
以15个补肾助孕颗粒特征图谱的23个共有峰峰面积为指标，得到15×23矩阵，采用SPSS 24.0软件进行聚类分析，选用组间均联法，以平方欧氏距离为度量标准聚类分析，结果如图 8所示。15批样品可以分为3类，S1、S4、S5、S9为一类，S2、S3、S10、S13、S14为一类，S6、S7、S8、S11、S12、S15为一类。不同批次的合格饮片所生产的产品含量差异会有较大差别，即使是同一批号合格饮片生产的产品也会因为加工问题导致各成分含量存在差异。
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图 8 15个批号的补肾助孕颗粒的聚类分析图 Fig.8 Cluster analysis of 15 batches of Bushen Zhuyun granules |
分别精密吸取混合对照品储备液适量，稀释为1、2、5、10、20、40倍的混合对照品溶液，精密吸取各混合对照品溶液10 μL，依法进样。以测得的响应信号峰和被测成分的进样浓度用最小二乘法进行线性回归，得到各成分的回归方程以及线性范围，结果见表 1。试验结果表明，各成分在各自的浓度范围内呈良好线性关系。
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表 1 回归方程、相关系数 |
分别精密吸取同一混合对照品溶液10 μL，连续进样6次进行测定。按峰面积计算，没食子酸、5-羟甲基糠醛、莫诺苷、当药苷、马钱苷、芍药苷、金丝桃苷、紫云英苷、迷迭香酸、丹酚酸B的RSD分别为1.1%、1.6%、1.9%、2.5%、2.7%、2.6%、3.0%、2.9%、1.6%、2.7%，结果表明仪器精密度良好。
2.4.3 重复性试验取同一批号的补肾助孕颗粒6份，分别按照“2.1.2”项下的方法制备供试品溶液，进样测定峰面积。按峰面积计算，没食子酸、5-羟甲基糠醛、莫诺苷、当药苷、马钱苷、芍药苷、金丝桃苷、紫云英苷、迷迭香酸、丹酚酸B的RSD分别为1.3%、0.45%、1.1%、3.0%、1.4%、2.6%、2.9%、1.4%、1.2%、1.3%，结果表明该方法重复性良好。
2.4.4 稳定性试验取批号为171011的S1样品0.8 g，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h进样测定，测定峰面积。按峰面积计算，没食子酸、5-羟甲基糠醛、莫诺苷、当药苷、马钱苷、芍药苷、金丝桃苷、紫云英苷、迷迭香酸、丹酚酸B的RSD分别为1.8%、1.9%、2.0%、1.8%、1.1%、2.7%、2.4%、2.2%、3.2%、2.1%，结果表明该方法重复性良好。
2.4.5 加样回收率试验取已知含量的同一批号补肾助孕颗粒各6份，每份约0.4 g，分别精密加入70%甲醇水配制得的浓度分别为1.60、1.80、1.84、0.49、1.05、1.00、1.44、1.60、1.20、1.18 mg·mL-1的没食子酸、5-羟甲基糠醛、莫诺苷、当药苷、马钱苷、芍药苷、金丝桃苷、紫云英苷、迷迭香酸、丹酚酸B 0.25、0.25、0.50、0.10、0.25、1.0、0.25、0.20、0.40、2.5 mL，并按“2.1.2”项下的方法制备供试品溶液，进样测定，计算加样回收率，结果见表 2。试验结果表明该方法准确度良好。
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表 2 补肾助孕颗粒加样回收试验结果 |
取15批补肾助孕颗粒样品，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下条件进样测定，采用外标计算法计算含量，结果见表 3。
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表 3 15批样品中10个成分含量测定结果 |
补肾助孕颗粒是按传统工艺制备的医疗机构制剂，因此，水溶性成分（即极性较大的成分）相对多一些，故选择研究和测定制剂中的极性成分。补肾助孕颗粒的处方药物组成中，菟丝子中主要含有黄酮类成分（金丝桃苷、紫云英苷）等[9]；炒白芍中主要含有皂苷类成分（芍药苷）等[10]；酒萸肉中主要含有环烯醚萜苷类成分（莫诺苷、当药苷、马钱苷）和有机酸类成分（没食子酸、5-羟甲基糠醛）[11-12]；丹参主要含有丹参酚酸类成分（丹酚酸B、迷迭香酸）等[13]。据文献报道[14-17]，上述成分具有保肝护肾及抗抑郁的作用，与补肾助孕颗粒的功效相关，故对这10个成分进行了含量测定。除了上述已测定的成分，菟丝子中的绿原酸为缩酚酸，本身不稳定，易分解[18]；酒萸肉中环烯醚萜苷类的马鞭草苷在山茱萸中含量较低；故不将上述成分作为指标成分。
方中柴胡中柴胡皂苷d在水煎液成分中易转化为次生皂苷，研究表明柴胡长时间煎煮的水煎液中检测不到柴胡皂苷d，说明柴胡皂苷d可能不会以水煎液的形式发挥药理作用[19]，并且其也无紫外吸收，因此，用紫外方法无法检测；鹿角片为动物类饮片，是鹿角去胶质的角块切片，其所含成分为氨基酸类、矿物质元素、蛋白与胶原蛋白、性激素类等成分[20-21]，故尚未见用HPLC进行定性或定量的报道；紫石英为氟化物类矿物萤石族萤石，主含氟化钙（CaF2），也未见用HPLC进行定性或定量的报道。因此，用液相色谱方法对该方中的这2味中药进行定性或定量目前尚无好的方法。
3.2 色谱条件的选择 3.2.1 检测波长的选择对混合对照品溶液进行了Waters2998PDA全波长扫描，发现目标成分在237 nm左右均有较好吸收，且色谱中目标峰的峰形也均较好。莫诺苷是酒萸肉的重要活性成分，在本制剂中含量较高，性质稳定，分离度好，其最大吸收波长是237 nm，故选择237 nm为检测波长。
3.2.2 流动相的选择考察不同流动相（乙腈-0.2%磷酸水溶液，甲醇-0.2%磷酸水溶液，乙腈-水），结果采用乙腈-0.2%磷酸水系统，相较于甲醇-0.2%磷酸水溶液，出峰速度快，芍药苷理论塔板数略降低但无较大影响；相对于乙腈-水，莫诺苷、马钱苷、金丝桃苷和丹酚酸B峰形与分离度均较好，基线较为平稳，故选择其作为流动相。
3.2.3 流动相梯度的选择本实验中测定的成分多为极性成分，故在确定流动相选择为乙腈（A）-0.2%磷酸水溶液（B）的基础上，研究了梯度变化对分离效果的影响。本制剂中，5-羟甲基糠醛、马钱苷、芍药苷及金丝桃苷附近干扰峰较多，文献也有类似报道，比较难以分离[22-24]；故选择该时间段内选择等度洗脱或低流动相变化洗脱，保证峰的分离度达到要求。其中15~30 min部分的梯度本实验还摸索过7%A等度洗脱、8%A等度洗脱、7%A→9%A梯度洗脱、7%A→10%A梯度洗脱多种条件，发现梯度为7%A→9.5%A时，莫诺苷分离度较好且对后续色谱峰无影响；31~55 min部分，此处使用12%A等度洗脱约20 min即可出峰，而11%A的长时间等度洗脱相较于12%A短时间等度洗脱虽然出峰时间延后，但可以使马钱苷、芍药苷的分离度更好且理论塔板数较高；11%A→20%A流动相部分色谱峰较少，但为了使基线平稳采用较长时间来过渡；65~95 min部分的梯度20%A等度洗脱、20%A→21%A、20%A→22A%梯度洗脱均能使目标峰分离，除了出峰时间不同外，差别较小，故选择出峰时间较快的20%A→22%A。综上所述，最终确定HPLC方法为以乙腈（A）-0.2%磷酸水溶液（B）为流动相，梯度洗脱（0~15 min，5%A→7%A；15~30 min，7%A→9.5%A；30~31 min，9.5%A→11%A；31~55 min，11%A；55~65 min，11%A→20%A；65~95 min，20%A→22%A；95~100 min，22%A→5%A）。
3.2.4 柱温的选择在上述梯度条件下，柱温对其中莫诺苷、马钱苷、当药苷和金丝桃苷的分离度也有影响，故考察不同的柱温（25，30，35 ℃）。《中华人民共和国药典》关于酒萸肉中的莫诺苷和马钱苷的测定方法中柱温为35 ℃[25]。柱温为30 ℃时，莫诺苷和马钱苷的分离度能够达到要求，且此时其他峰分离度良好；柱温为35 ℃时，当药苷的分离度下降，其余成分分离度良好；柱温为25 ℃时，当药苷的分离度更优，但莫诺苷及金丝桃苷分离度下降。综合考虑，选择30 ℃作为柱温。
3.3 结论综上所述，本实验建立了补肾助孕颗粒的特征图谱，共有23个共有峰，方法学考察符合要求。通过特征图谱和单味饮片以及对照品进行相关性对比，对部分色谱峰进行了归属，并用中药色谱指纹图谱相似度评价软件（2004A版）进行相似度分析，15批制剂的相似度均大于0.98，结果表明15批制剂间相似度高，建立的特征图谱能较全面地反应制剂中的整体成分。同时建立了没食子酸、5-羟甲基糠醛、莫诺苷、当药苷、马钱苷、芍药苷、金丝桃苷、紫云英苷、迷迭香酸、丹酚酸B含量的测定方法，为补肾助孕颗粒的质量控制和研究奠定了基础。
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