2020, Vol. 40 
2. 武汉市第八医院药剂科, 武汉 430010;
3. 湖北省妇幼保健院药剂科, 武汉 430070
2. Department of Pharmacy, The Eighth Hospital of Wuhan, Wuhan 430010, China;
3. Department of Pharmacy, Hubei Maternal and Child Health Hospital, Wuhan 430070, China
1993年，Lee及其同事无意间在秀丽隐杆线虫中发现miRNA lin-4[1-2]，而这一现象当时被认为是自然界中存在的小概率异常现象，并没有引起过多关注。直到2000年，Reinhart等[3]发现miRNA let-7及其调控基因lin-14的能力，才使得miRNA作为一类新的调控核酸引起了爆炸性的研究关注。miRNA是一类短链非编码核糖核酸（RNA）分子，长度为19~25个核苷酸。据估计，miRNA至少调控人类全部基因转录的20%~30%[4]。miRNA涉及到大量的不同的生物过程，如细胞增殖、分化、代谢、胚胎发生、炎症、衰老和程序性细胞死亡等[5]。前期研究已经证明，miRNA的异常表达会导致多种人类疾病，包括癌症、神经退行性疾病、糖尿病、心脏病、肾脏疾病、肝脏疾病和免疫系统功能改变[6-8]等。由于miRNA参与疾病的起源和发展，并且具有病理特异性，以稳定形式存在于包括血液、唾液、尿液在内的体液中，因此miRNA已被提议作为用于疾病的早期检测、分类、预后和预测性诊断的生物标志物[9-10]。
为了能够在临床实践中将miRNA作为生物标志物，必须准确测定其表达水平。在过去的十几年中，miRNA检测方法的发展已成为一个独立的研究领域，但是检测miRNA依然面临着重大的挑战，主要是因为miRNA的内在特征：序列短，各成员之间的序列相似度高，缺乏能够使其选择性扩增的共同特征，含量水平低。迄今为止，已经开发了多种用于检测miRNA的技术，包括用放射性标记的探针进行RNA印迹分析[11]，基于微阵列[12]和基于聚合酶链式反应（PCR）的方法[13]，液相单细胞测定[14]，原位杂交[15-16]和高通量测序[17]等。然而，这些方法都有其固有的局限性。选择合适的miRNA检测方法主要取决于具体的实验目的。一种理想的miRNA表达水平分析方法应该满足几个要求：即使在样本容量很少时，其检测下限也足够敏感来提供对miRNA含量水平的定量分析；特异性强，能够检测miRNA之间的单核苷酸差异；多通道能力强，能够平行检测多个样品；操作简易而不需要昂贵的试剂或设备[18]。
本篇综述讨论了用于miRNA检测的一些常规技术，包括标准PCR、RNA印迹和微阵列方法，以及一些新的检测技术。这些方法有助于阐明miRNA在体内的生物发生过程和生物学功能。此外，还介绍了用于该领域的各种实验技术的优缺点以及挑战和新方向。
1 RNA印迹RNA印迹（Northern blotting）是系统性分析miRNA表达最早的方法尝试[19-21]，广泛用于可视化检测各种大小的miRNA表达，包括从长的原始miRNA到成熟形式的miRNA[22-23]。该技术能够检测目标miRNA的表达水平（半定量），确定它们的长度以及验证预测的miRNA。其一般步骤如下：含有miRNA的样品在电泳凝胶上分离，再将凝胶上的RNA转移到硝酸纤维素膜上，然后通过与靶miRNA互补的荧光或放射性标记的探针杂交，最后通过荧光或放射性元素检测信号。尽管RNA印迹通量低，灵敏度低，并且耗时和样本消耗量大[24]，但是它依旧被广泛作为新检测方法验证的金标准[25]。
许多文献报道了对RNA印迹技术的各种改进[26-33]。这些方法主要在于探针标记检测上的不同和探针设计方法的不同。使用最普遍的探针标记方案是基于掺入放射性同位素（32P）[33]。然而，同位素标记常常不易操作且对人体有害，所以被许多机构限制使用。作为一种更安全的替代方法，地高辛（DIG）标记系统具有几个优点：灵敏度高，曝光时间短，保质期长，安全性高。Ramkissoon等[26]报道了使用DIG标记的RNA寡核苷酸检测小分子RNA（~22个核苷酸），并证明DIG标记的RNA探针与32P标记的探针相比在检测miRNA时具有同样的灵敏度。而Miller等[27]以近红外荧光作为探针也取得了不错的灵敏度，同时保证了探针的稳定性，并且采用不同的荧光能够保证多通道的测定。
探针设计方案近年来也得到了显著改善。传统的DNA寡核苷酸探针越来越多地被锁核酸（LNAs）寡核苷酸探针取代，这大大提高了检测miRNAs的灵敏度[31-32]。在RNA印迹中，LNA修饰的寡核苷酸探针已经显示出比传统DNA探针至少高10倍的检测灵敏度[32]。
提高RNA与膜的交联程度也有助于提高RNA印迹的灵敏度。然而，常规方法如UV-交联对于检测小RNAs通常不是最佳的方案。因此，1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺（EDC）已用于将RNA交联到尼龙，这使得miRNA的检测灵敏度提高了25~50倍[28-29]。
Kim等[30]报道了一种新的基于RNA印迹的miRNA检测方法，使用EDC将RNA交联到膜上，然后用DIG标记的LNA探针杂交。该方法可以产生清晰可见的信号，总RNA量低至0.05 fmol，与基于同位素方法的曝光时间相比，缩短约1 000倍。
2 微阵列在用于miRNA表达分析的技术中，基于微阵列的检测对高通量分析多组miRNAs特别有效[34]。然而，需要进一步验证以更准确地量化miRNA的表达水平[35]。微阵列基本原理是基于靶miRNA分子与其相应的互补探针之间的核酸杂交。miRNA寡核苷酸探针通常具有氨基修饰的5’末端，通过氨基和自组装单层膜（self-assembling monolayer，SAM）之间的共价交联固定在载玻片上，形成即用型miRNA微阵列。提取出来的RNA用荧光染料标记，然后与微阵列探针杂交，标记的miRNA与相应探针特异性结合，再检测载玻片上不同位置的荧光信号。因此，可以通过分析荧光信号强度来评估研究样品中miRNA的类型及其相对量。由于miRNA的序列短且丰度低，目前开发的基于微阵列的策略着眼于改进探针设计和miRNA标记[36]。
一些文献已经报道了通过DNA微阵列来检测miRNA[37-38]。然而，所有基于DNA的寡核苷酸微阵列平台的主要缺点是难以获得适用于全基因组的解链温度（Tm）标准化的探针组。为了解决这个问题，在miRNA微阵列中引入了锁核酸（LNA）修饰的捕获探针以达到Tm标准化。重要的是，LNA的加入改善了对碱基错配的区分能力，从而降低了对miRNA的纯化和扩增的需要[39]，并提高了检测的稳定性，降低了生物系统毒性。应用2’-O-（2-甲氧基乙基）修饰的寡核糖核苷酸[40]，并根据目标miRNA[41]的理化性质调整探针长度，都可用于平衡Tm[42]。将发夹结构并入到探针5’末端，能够增强区分靶miRNA与miRNA前体的能力[41]。此外，引入外源性和内源性阳性对照和阴性对照探针以协助标准化，为微阵列提供绝对参考，这对于改善质控效果，提高定量比较准确性显得尤为重要。
2003年，Krichevsky等设计了一种寡核苷酸阵列，可以通过用放射性同位素标记小RNA来检测miRNA[42]，但随后迅速被其他标记技术所取代[43]。首先荧光标记生物样品中miRNA，然后与阵列上的探针结合是最常见的大规模miRNAs平行分析策略[43]。由于miRNA序列短，miRNA分子的直接标记具有一定优势。
酶标记miRNA主要包括2种方法。一种是使用T4 RNA连接酶来催化荧光基团修饰的核苷酸或短寡核苷酸与miRNA 3’末端的连接；然而，由于可能存在分子内连接反应，该方法可能导致环化。另一种酶标记法涉及2个步骤，荧光修饰的寡核苷酸在miRNA 3’加尾，然后通过拼接反应而连接，这种方法避免了环化的问题，但可能在尾部添加大量不定数量的核苷酸[43]。在这2种方法中，酶对某些序列与荧光基团的连接比其他序列更有利，因此产生不同的假象。并且这些偏差往往在降解样品中更严重[44-45]。为了尽量减少miRNA之间结构和序列差异的干扰，Wang等[41]将二甲基亚砜（DMSO，一种有效的RNA变性剂）引入反应溶液中，发现浓度为20%的DMSO刺激了T4 RNA连接酶活性。基于酶的标记方法的另一缺点是它们不能检测5’末端错配，因为酶只有核酸3’端的连接活性。此外，对于在3’末端具有天然修饰的miRNA（例如植物miRNA），酶标记也存在问题[46]。
另外，miRNA标记的化学方法包括沿着miRNA进行基于烷基化的标记（例如MiRNA Bio Label IT）以及基于与核酸的铂配位化学的方法（例如Kreatech ULS）[43]。然而，化学标记方法对3’末端是不敏感的，由于通过选择性标记某些核苷酸而使标记效率高于其他核苷酸，从而被质疑带入偏差[47]。
在酶和化学标记方法中，与成熟miRNA共存的miRNA前体（pre-miRNA）可能被标记，导致背景信号增高以及交叉杂交。使用基于柱色谱或凝胶色谱纯化的方法初步分离小RNA，可能有助于解决前体与成熟体混合的问题。此外，必须进行背景校正和标准化，以消除杂交时和荧光检测扫描时荧光标记带来的偏差和差异。目前主流的商用miRNA微阵列都是基于标记的，但是有报道它们在平台间一致性方面表现不佳[48]，可能是由于标记程序相关的缺点[34]。虽然在Nelson等[49]设计的RAKE（基于RNA-引导和阵列的Klenow酶法，RNA-primed，array-based Klenow enzyme assay）中通过杂交后标记部分解决了一些问题，但是依旧存在需要使用2种不同酶的问题。
不需标记和扩增反应的miRNA微阵列检测方法可以明显简化过程并极大地提高miRNA分析研究的可信度，尤其适用于用作诊断。在过去的10年中，不断开发出用于直接检测miRNA的非标记方法[50-51]。这些工作主要集中在2个方面：一是标记二级探针而不是靶标miRNA，二是利用特殊设备。
“堆叠杂交”（stacking hybridization）也被引入到无标记miRNA微阵列中，从而在1个步骤中同时满足结合目标捕获和获取荧光信号，而不用标记目标miRNA。在这个方法中，将提取的总RNA直接应用于微阵列进行检测，当探针捕获到目标miRNA时，带有荧光基团连接的短寡核苷酸通用标签可通过碱基堆叠效应，选择性结合到探针。这种堆叠杂交通用标签测定法已成功用于分析低至100 ng的总RNA，并且发现对于均一的miRNA具有高度特异性[46]。具有高鉴别单碱基差异能力的堆叠杂交通用标签微阵列测定法，适用于无偏差分析正常和甲基化miRNA。
除了调整杂交形式外，miRNA的新识别元素也被用于无标记miRNA的检测。Lee等[51]描述了第1个使用基于抗体样蛋白的微阵列法，通过将双链RNA结合结构域（double-stranded RNA-binding domain，dsRBD）与PAZ（Argonaute蛋白的1个结构域）结构域连接来检测miRNA。PAZ是一种RNA结合区域，可以特异性识别3’端外突2个碱基的dsRNA[52]。dsRBD可以进一步稳定RNA-PAZ复合物。PAZ-dsRBD作为RNA的结合物类似于抗体的作用，能够灵敏检测浓度范围为10~500 pmol·L-1的miRNA，而无需酶促扩增或标记反应。通过添加信号放大酶进行类似ELISA的检测，进一步改造PAZ-dsRBD构建体可能会提高灵敏度[49]。
总之，miRNA微阵列对于大通量平行测定来说具有费用低的优点。目前，许多公司提供了用于miRNA分析的微阵列平台。因此，miRNA微阵列已成功用于探索miRNA在生物发育、组织分布、正常和异常状态之间的差异miRNA表达、疾病表征、干细胞发育、通路作图、作用机制和肿瘤发生。其局限性包括限定的浓度范围，在某些情况下对于序列密切相关的miRNA特异性不强，不能比较不同技术之间的结果以及缺乏对miRNA水平的绝对定量。
3 实时定量PCR实时定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）是目前定量基因表达的金标准[53]。qRT-PCR具有高敏感性、准确性和实用性，是生命科学中比较表达分析的一种强大技术[54]。然而，对于一个平均长度为~22 nt的miRNA，设计常规PCR检测方法仍是一个挑战。基于qRT-PCR的miRNA分析的主要步骤为将miRNA逆转录成cDNA，然后通过qPCR实时监测反应产物积累。该技术平衡了检测成本、精密度和样品量，常用于miRNA的表达水平分析和验证其他方法获得的结果（如微阵列和RNA印迹分析）[55]。
qRT-PCR方法的发展使得miRNA检测的灵敏度提高到只需要几纳克总RNA[56]。但是，必须考虑到RNA完整性、cDNA合成、引物设计、扩增子检测和标准化等几个参数，才能获得有意义且可重复的结果。miRNA的逆转录包括2种常用策略，一种是miRNA特异性逆转，另一种是通用性逆转[57]。在前一种策略中，使用miRNA特异性逆转录引物仅转录特定的miRNA。引物的3’末端必须与miRNA互补[58-59]。5’末端的茎环有助于减少引物对pre-和pri-miRNA的退火。茎环引物的缺点是对异靶标miRNA序列的逆转录能力降低[60]。使用茎环逆转录引物和miRNA特异性TaqMan探针的TaqMan miRNA检测通常被认为是miRNA检测的“金标准”[61]。TaqMan改进版[62-63]和基于SYBR Green用于qRT-PCR测定miRNA，最近也见于报道[64-65]。在后一种策略中，通过在所有miRNA末端加上一段相同的序列（尾巴），如将大肠杆菌poly（A）聚合酶对所有miRNA进行多聚腺苷酸化后，再通过通用引物在逆转录酶的作用下，在其配对的核苷酸的5’末端加寡（dT）序列[66-67]。poly（A）聚合酶方法更适合于检测用量小的样本（如血浆）中miRNA。然而，它既不能区分pre-miRNA与成熟miRNA，也不能检测携带在其3’末端进行2’-氧甲基修饰的miRNA（2’-OMe RNA，如植物miRNA）。
进行高度平行的qRT-PCR的障碍在于每个反应的最佳反应条件可能有很大差异，由于引物不同而导致退火温度不同。在引物中引入LNA以标准化最佳杂交条件是解决此问题的有效策略[43]。多家制造商提供了qRT-PCR试剂盒，可以评估数百种miRNA，并且一些方法还可以提供可定制的分析方法[44]。采用阵列/qRT-PCR定量在体液循环中（如血浆）的miRNA需要添加“内标”来标准化[35]。对于qRT-PCR，更大的问题是用于miRNA测定的标准化。大多数归一化曲线依赖于小RNAs的基因，这些基因可能不会被相同的聚合酶转录，并且不太可能代表一般的miRNA调控[44]。另一种标准化技术使用每个样品中存在的平均miRNA[68]。然而，所选参考值在样本间是否保持恒定也是未知的。
用于miRNA检测的qRT-PCR技术的发展主要集中在互补DNA（cDNA）合成的创新。Ro等[67]报道了名为“miRNA-ID”的基于环化的测定平台。miRNA-ID的特征是通过连接酶将miRNA环化并逆转录环化miRNA。环状RNA和多聚体cDNA模板在引物定位方面提供了无与伦比的灵活性，这些引物跨越了miRNA序列之间的差异。
T4 DNA连接酶可以修复DNA-RNA杂交体中DNA链中的缺口，并与以碱基序列大小相关的DNA探针结合，检测总RNA中的多个miRNA，检测下限低至1 pmol·L-1（~105 copies·μL-1）[69]。最近新建立了一种无需逆转录的RT-PCR方法用于快速定量5 amol至500 fmol范围内的miRNA[70]。指数扩增过程仅在目标miRNA存在时才能有效进行，通过miRNA和桥接序列的连续堆叠杂交，从而增加了对异二聚体的额外稳定性。
为了进一步提高灵敏度，Zhang等[71]证明以待分析靶标miRNA作为模板，通过T4 RNA连接酶可以有效连接预先设计的DNA探针，其中一条探针预先用核糖核甘酸修饰。用3个核糖核苷酸修饰DNA探针3’末端可以大大提高连接效率，并且可以检测到低至0.2 fmol·L-1（例如4 zmol）水平的miRNAs。测定范围跨越7个数量级，这与qRT-PCR测定的灵敏度相当。高特异性可以很好地区分miRNA序列之间的单核苷酸差异以及成熟miRNA与其前体。
4 基于等温指数扩增的检测方法等温扩增是寡核苷酸扩增的常用方法，主要是同时利用聚合酶和切口酶的活性[72]。该技术利用位点特异性序列延伸和切口，指数生成和释放所需的延伸产物。通过这种方式，可以将微量的检测目标转化为大量的延伸产物[73]。由于其等温性质，该技术相对于PCR具有快速扩增动力学和良好的扩增效率，无需专门的仪器[74]。这种方法特别适用于miRNA的扩增。然而，为了启动等温扩增，需要一个触发器（trigger），模板必须含有切口酶识别的特定序列[72]。尽管可以在恒定温度下来运行，但等温扩增仍然具有复杂的要求，从而增加了出错的几率和成本[75]。基于早期的研究，miRNA等温扩增的最新发展集中在简化反应体系，使每个项目发挥多种作用，然后利用不同的信号输出单元提高灵敏度以及更加方便地测定[76]。
Li的团队设计的一种方法是miRNA等温扩增法的一个典型例子[77]。在其建立的检测系统中，靶miRNA直接被设计成等温扩增的触发器。该模板设计为含有2个相同的片段，这些片段具有的特点是：（1）与目标miRNA互补；（2）与切口位点相邻，其中1个位于片段上游，另1个位于片段下游。采用这种设计，不仅在切割位点发生延伸和切割，而且释放的序列也可以作为触发器重复使用。以这种方式，靶miRNA被指数扩增。使用常见的荧光染料SYBR Green I，检测可以实时进行，就像实时PCR一样。
为了进一步简化检测系统，Li的研究小组开发了另一种检测扩增程序，称为环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP），其仅包含1种单一的酶Bst DNA聚合酶[78]。除了其DNA聚合酶活性外，Bst DNA聚合酶还显示RNA聚合酶活性（DNA作为模板）和链置换活性。利用这些特点，可以使用上述设计良好的模板和引物进行多个链延伸循环。最后，如上述系统中那样，可以使用SYBR Green I检测生成的环茎类延伸产物。随着重复链延伸和置换，环茎DNA产物被进一步扩增。在这里，靶miRNA也有助于扩增过程的触发。这种miRNA检测设计消除了对切口酶的需求，并实现了实时检测，具有在amol水平的检测下限。然而，此方法的模板和引物的设计很复杂，1套探针只适用于1个靶标。这些因素增加了体系的复杂性和成本，尤其是考虑将此方法应用于临床诊断时。在2013年，Duan等[79]设计了一种改进的等温扩增系统用于miRNA的超灵敏检测，实现了单细胞水平的检测灵敏度并且能够直接检测细胞提取物。
5 基于滚环扩增的检测方法滚环扩增（rolling circle amplification，RCA）是另一种常用于扩增DNA和RNA的等温反应，并且具有良好的特异性和灵敏度[80-81]。该方法特别适用于miRNA的检测，因为这些短链RNA是连接反应的理想模板，而模板恰恰是启动等温滚动循环放大过程的必须物。Jonstrup小组[82]于2006年最早报道使用RCA进行miRNA检测。近年来，一些基于RCA改进的方法具有更高的特异性和效率[83]。这些新方法利用Phi29 DNA聚合酶强大的链置换聚合酶活性和3’到5’外核糖核苷酸活性[84-85]，通过设计特殊的类似于挂锁[86]或哑铃状探针[87]以及加入第2种引物，可以实现非常高的扩增效率，从而为高度敏感的miRNA检测提供必要的扩增[88]。在这些实施方法中，使用SYBR Green I荧光完成检测，该检测提供了具有良好线性相关性且准确的定量。在设计基于RCA的系统时，特异性一直是最重要的考虑因素，因为不依赖于模板的连接，可能导致非特异性扩增，这会导致背景问题和较低浓度下的变异。因此，需要优化条件并仔细选择连接酶。
最近，Li的研究小组[89]开发了一种将RCA与toehold介导链置换（TMSD）相结合的新方法，然后将其应用于原位miRNA检测。本研究中，将探针专门设计为哑铃形的密封探针，这种设计在TMSD和RCA中都起到了关键作用。将目标miRNA设计为启动TMSD过程的引物，当结合时导致探针发生结构改变。而RCA反应的启动取决于这种结构变化，否则它将保持非活动状态。此处如同之前的RCA反应，同样也使用Phi29 DNA聚合酶。与之前的RCA方法相比，即使与基于锁式探针相比，这种设计显示出了更好的特异性。这种特异性的增加归因于系统的TMSD方面和设计良好的哑铃形密封探针，而它与连接或酶识别无关。这种设计的另一个改进是其原位检测的可行性，由于其高效放大RCA，其显示比原位荧光杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）更好的灵敏度。
6 基于纳米材料的检测方法纳米材料是生物分析和生物靶向检测的有力工具，因为其能够提供高灵敏度和高效率，尤其是与其他技术，如电化学相关方法[90-91]、表面等离子共振技术（SPR）[92]、微阵列[93]等结合使用时更为显著。到目前为止，各种广泛研究的纳米粒子已应用于miRNA检测，如金纳米、银纳米粒子、磁性粒子、量子点、氧化石墨烯等[94-95]。2006年初，Fang等[96]报道了一种灵敏度高达10 fmol·L-1的miRNA检测系统，该系统使用阵列平台结合金纳米粒介导的信号放大和SPR成像技术构建检测系统。2017年，Fan等[97]报道了一种基于纳米金和发卡结构锁定DNA酶探针用于miRNA的检测技术，利用纳米金的特殊性成功地在活细胞中进行了miRNA成像。
最近，发展了一种包被蛋白p19的磁性纳米粒与电化学生物传感器平台相结合的平台用于检测miRNA，该平台可以提供原位及有效的检测系统，检测下限低至0.4 fmol[98]。该研究利用蛋白p19作为目标识别的受体，因为p19蛋白能够结合在21~23个核苷酸长的双链RNA，miRNA链长刚好在这个范围内。通过与磁珠结合，该技术可用于从液相中富集和分离靶标miRNA。对于目标miRNA的富集和分离，miRNA需要与其相应的反义对应物杂交以形成双链，然后可以通过磁珠捕获。同时，miRNA的互补序列是生物素标记的，可以被链霉亲和素捕获。因此，通过过氧化氢催化氢醌氧化反应的Strep-HRP聚合物（辣根过氧化物酶与链霉亲和素共价连接）系统可以与磁珠-miRNA系统连接，以产生电化学信号作为读出信号。由于没有涉及核酸扩增，本研究中的检测是直接的，简单方便，而且这种设计可以与用于多重目标检测的其他技术（例如阵列）组合。由于灵敏的电化学响应，即使不进行信号放大，该方法也表现出良好的灵敏度。
Lee等[99]报道了名为bio-BaGel的测定方法，该方法利用金纳米颗粒（AuNPs）和磁性纳米粒一起提供靶向分离和富集。此前基于纳米颗粒的生物条码法只是应用于检测目标DNA和蛋白质[100]。所谓的生物条形码总是归因于根据检测系统中的每个目标特别设计的一组探针，其可以用于多通量检测。在这个例子中，作者设计了条形码探针及其相应的互补条形码。该方法中磁性颗粒仍然起着分离工具的作用。然而，与传统方法不同，此方法中的液相中的分离物不仅包括目标miRNA，而且还包括条形码探针功能化的AuNPs。信号读数不是直接来自靶标本身，而是来自凝胶分析中根据每个靶标设计的一系列条形码dsDNA。目标miRNA的作用是成为将条形码探针与隔离系统连接起来的桥梁。具体的，条形码探针含有2个与AuNPs连接的区域：1个用于被目标miRNA捕获，另1个用于形成编码dsDNA。通过与目标miRNA和磁珠上的探针形成三明治样杂交体，可以分离和富集条形码探针。变性和AuNPs溶解后，条形码探针可被释放，以形成具有其相应条形码互补的dsDNA。然后凝胶分析将同时读出代表不同目标miRNA的不同条形码dsDNA。在此方法中，信号输出仅依赖于靶标和条形码探针之间的杂交，而不依赖任何循环和/或酶促反应。因此，这种方法更简单，交叉污染或副作用更小。鉴于目标miRNA转换为条形码探针的信号，并且条形码探针可以在高负载下用AuNPs进行功能化，该系统的灵敏度足以用于miRNA的检测。
7 展望miRNA在人类的发育、代谢和疾病过程中发挥重要作用。它们被视为细胞事件或早期疾病诊断的有用生物标志物。由于成熟的miRNA序列很短，只有大概19~25个核苷酸，并且其具有家族序列高度相似性以及低表达的特点，因此创建用于在复杂样品中快速、特异和灵敏检测miRNA的高效工具变得十分重要。包括RNA印迹、微阵列和qRT-PCR在内的常规miRNA检测技术对于筛选miRNA具有各自的优势。本文提供了一些常用的miRNA检测技术的优缺点以及它们的改进方案，也介绍了几种检测miRNA的新策略（见表 1）。目前已经有相当多的方法用来检测miRNA，但是作为临床常规生物标志物的检测，这些方法仍然存在相当大的局限性，这与miRNA本身的特征，以及检测的速度、成本相关。随着新技术新方法的不断发展，检测人员在miRNA的检测方面有了更多的选择，但必须综合考虑具体的试验目的和各种方法的优缺点，以获得最佳而又最经济的试验结果。要使miRNA作为标志物走向临床，其检测的标准化是关键。虽然目前方法众多，但是能够提供快速、准确、重复性好且绝对定量的方法仍然需要进一步的努力。
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表 1 同miRNA测量方法的特点比较 Tab.1 Advantages and limitations of various miRNA detection assays |
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