腺相关病毒（AAV）是一种小的无被膜单链DNA病毒，基因组长度约为4.7 kb，基因组的两端为反向末端重复序列（ITR），ITR是病毒包装和传代所必须的最少自身序列，也是各种重组腺相关病毒（rAAV）载体所共有的AAV源序列^[1]。基因组的中间为2个开放阅读框Rep和Cap^[2]，基因治疗的rAAV载体将Rep和Cap基因替换为外源基因及其调控元件^[3]。rAAV基因治疗载体近年来得到了迅速的发展^[4]，其对人类无致病性，具有高转导效率，低炎症反应和广泛的宿主靶向性等优点，是基因治疗领域最具前景的载体之一。截止2018年11月13日，145例rAAV相关的临床试验已经在clinical trails.gov注册^[4]。

rAAV基因治疗药物的质量控制是产品研发和生产的一个重要环节^[5]，其中准确的滴度测定是一项关键性指标。AAV基因治疗药物的临床剂量通常基于rAAV载体的基因组滴度，准确地定量载体是药物获得最大疗效和最小毒性的前提条件^[6]，也是不同工艺和不同厂家产品横向比较的依据^[7]。rAAV基因组滴度目前常用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，Q-PCR）方法测定，采用已知拷贝数的质粒DNA作对照品，将系列稀释的质粒DNA与病毒DNA一起进行Q-PCR，根据标准曲线计算待测样品的拷贝数^[8]。但是实验结果表明传统方法测定结果的重复性差，相同样品在同一人不同次实验，以及不同实验室之间测定结果均存在显著的差异。

基于以上研究背景，本文对测定rAAV-9基因组滴度的传统Q-PCR法进行改进，用病毒对照品代替质粒对照品，统计方法由平行线法代替传统单点法，以提高测定结果的重复性。

1 实验材料 1.1 实验仪器

7 500 Fast实时荧光定量PCR仪（ABI）；M- CENTRIFUGE离心机（AndyBio）；DU 800核酸蛋白分析仪（BECMAN）；96孔PCR板（ABI，货号4346906）。

1.2 样品及试剂

2×Taqman universal Master MixⅡ，with UNG（ABI，货号4440038）；SDS（国药集团化学试剂有限公司，30166428）；EDTA（Thermo Fisher，AM9912）；DnaseⅠ（TAKARA，2270A）；引物和探针（fwd-ITR-primer：GGAACCCCTAGTGATGGAGTT；rev-ITR-primer：CGGCCTCAGTGAGCGA；AAV2-ITR-probe：CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG）^[8]，由Thermo Fisher合成；本实验所用的rAAV-9病毒样品（批号2019022801）、rAAV-9病毒对照品（批号2014102611，基因组滴度2.2×10¹³ copies·mL^-1）及质粒对照品（pAAV2neo-egfp，基因组滴度1.1×10¹¹ copies·mL^-1）均为中国食品药品检定研究院重组药物室留样。

2 方法与结果 2.1 检测方法 2.1.1 对照品和样品的预稀释

将质粒对照品用超纯水预稀释30倍，然后2倍系列稀释7个稀释度，各稀释度下质粒对照品溶液分别用于“2.1.4”项下Q-PCR的试验。病毒对照品、病毒样品分别用超纯水预稀释200倍，然后2倍系列稀释7个稀释度，各稀释度下病毒对照品溶液和病毒样品溶液分别用于“2.1.2”“2.1.3”“2.1.4”项下的试验。

2.1.2 外源DNA的去除

分别取各稀释度的病毒对照品溶液、病毒样品溶液5 μL，按照如下体系配制反应混合液：5 μL rAAV-9病毒样品溶液或病毒对照品溶液，5 μL 10×DnaseⅠ缓冲液，2 μL DnaseⅠ，38 μL超纯水。37 ℃孵育30 min，去除外源DNA，80 ℃孵育10 min，灭活Dnase Ⅰ，即得消化液。

2.1.3 病毒的裂解

分别采用SDS或EDTA裂解病毒。在SDS裂解法中，将上述消化液加入0.2% SDS 50 μL，95 ℃ 30 min裂解病毒，即得裂解液。EDTA裂解法中，将上述消化液加入20 mmol·L^-1 EDTA 50 μL，95 ℃ 30 min裂解病毒，即得裂解液。

2.1.4 Q-PCR

用超纯水将上述裂解液稀释100倍，以去除裂解试剂对Q-PCR的抑制作用，然后分别以各稀释度病毒对照品、病毒样品的裂解液及各稀释度质粒对照品溶液为模板，配制如下反应体系：5 μL DNA模板，0.5 μL fwd-ITR-primer，0.5 μL rev- ITR-primer，0.5 μL AAV2-ITR-probe，10 μL 2× Taqman universal Master MixⅡ，3.5 μL超纯水。根据以下反应程序进行Q-PCR：50 ℃ 2 min；95 ℃预变性10 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火延伸30 s，40个循环；37 ℃ 2 s。

2.1.5 结果的计算

平行线法：采用平行线法分析结果时需要预试验，寻找平行范围。本研究首先将相近浓度的样品和对照品以较大的稀释倍数（如4倍）倍比稀释，寻找到大概的平行范围，然后缩小稀释倍数（如2倍），寻找最佳平行范围。选择质粒对照品、病毒对照品、病毒样品任意二者之间平行性均好的5个稀释度范围进行计算。以质粒为对照品时，选取质粒对照品和病毒样品分别对应的的Ct值，根据平行线法^[9]进行计算，同时乘以样品预稀释及处理过程中的稀释倍数，得出rAAV-9基因组滴度；以病毒为对照品时，选取病毒对照品和病毒样品分别对应的Ct值，根据平行线法进行计算，同时乘以样品预稀释及处理过程中的稀释倍数，得出rAAV-9基因组滴度。单点法：以病毒为对照品，根据标准曲线用外标法进行计算，同时乘以样品预稀释及处理过程中的稀释倍数，得到rAAV-9的基因组滴度。

2.2 方法改进结果 2.2.1 病毒裂解方法的选择

根据“2.1.3”项方法，比较SDS和EDTA的裂解效果，结果如图 1所示，SDS裂解后测定结果显著高于EDTA，表明SDS裂解效率高于EDTA，所以SDS裂解法是较优的方法。对SDS裂解浓度进行优化，比较不同浓度SDS裂解效果，结果如图 2所示，终浓度为0.1%的SDS裂解后测定结果值最高，裂解效果最佳，故选择在此SDS终浓度下裂解病毒。

2.2.2 对照品的比较

质粒和病毒分别做对照品，根据平行线法计算rAAV-9的拷贝数，病毒对照品由质粒对照品根据平行线法标化，计算结果见表 1，质粒做对照品的测定结果精密度差，RSD为35.9%，病毒做对照品的测定结果精密度较高，RSD为13.7%，所以选择用病毒对照品替代质粒对照品。

2.2.3 统计方法的选择

用病毒做对照品，分别根据单点法和平行线法计算病毒样品拷贝数，结果见表 1。单点法测定结果精密度较差，RSD为23.1%；平行线法计算结果精密度较好，RSD为13.7%。所以选择用平行线法代替传统单点法分析结果。

2.3 方法学的初步验证 2.3.1 准确度

用超纯水将病毒对照品稀释1.5倍后按照改进后方法测稀释后对照品拷贝数，比较实测值和理论值的关系，3次实验结果表明，回收率在90%~120%之间，准确度较好。

2.3.2 精密度

根据改进后方法测rAAV-9样品拷贝数，每天做1次试验，连续做3 d，结果显示，3次实验均值为1.54×10¹³ copies·mL^-1，RSD为11.4%，精密度较好。

3 讨论

在rAAV基因治疗药物的质量控制研究中，滴度的测定扮演着重要的角色，由于传统方法的测定结果重复性差，本研究中对传统方法进行了裂解试剂的选择、对照品的比较和统计方法的选择等方面的改进。

目前测定rAAV基因组滴度报道最多的是Q-PCR方法，用Q-PCR方法测rAAV基因组滴度主要有2种思路，一是SDS或EDTA裂解病毒后进行Q-PCR，二是试剂盒提取DNA后进行Q-PCR^[10]。本研究对裂解方法进行了选择优化，选出了较优的裂解试剂SDS及裂解浓度0.1%。至于试剂盒提取DNA的方法，实验过程发现用试剂盒提取后测定结果重复性差，考虑到不同试剂盒的提取效率不同，且提取过程中所添加的试剂可能会对Q-PCR产生影响，本研究中舍弃了试剂盒提取的方法，选择了裂解法。

传统裂解法中质粒为对照品，并未参与病毒的前处理过程，不能对其进行控制，为非同质对照品。本研究用病毒对照品代替了质粒对照品，为同质对照品，提高了测定结果的精密度。此外，质粒对照品结构与病毒基因组结构差异较大（质粒中的ITR序列处于非游离状态，而病毒基因组中的ITR序列是游离状态），这种结构差异会导致二者的扩增效率不一致，与D′Costa等^[11]的研究结果相一致。

与此同时，本研究也对统计方法进行了选择，将传统的单点计算法替换为平行线法，进一步提高了实验的精密度。传统方法中结果的计算只参考了病毒样品1个点的数据，数据不充分，无法对结果的可靠性进行准确判断，而平行线法结果的计算参考了多个点的数据，结果的重复性高。而且平行线法在计算结果的同时进行了线性、平行性的判断，可检验对照品、样品的扩增是否呈线性及对照品和样品扩增是否同步等，结果更可靠。

总之，本文完善了rAAV-9基因组滴度测定方法，提高了对重组腺相关病毒基因治疗药物的质控水平。