2019, Vol. 39 
补肺丸是由熟地黄、党参、紫菀、黄芪（蜜炙）、桑白皮（蜜炙）、五味子六味药材加炼蜜制成的大蜜丸，具有补肺益气、平喘止咳的功效，临床主要用于肺气不足、咳喘气短、有粘痰、咽喉干燥等病症[1-2]。方中君药熟地黄具有滋补肝肾、填精益髓的功效，臣药桑白皮具有利肺平喘的功效，佐药五味子具有益气生津的作用，与处方中的功效基本一致。现行补肺丸的执行标准为中药成分制剂部颁标准WS8-B-0089-89，该标准项下对处方中的六味药只是通过显微鉴别和丸剂的通则标准进行质量控制[3]，具有一定的局限性，不能更好地反映药品的质量。目前有报道对补肺丸中黄芪甲苷和五味子醇甲的含量进行测定[4]，未见有多成分同时测定的报道，而单一的成分测定不能反映整体处方的质量。本实验参考文献报道[5-14]，对处方中的熟地黄、桑白皮和五味子三味药材中的代表性成分毛蕊花糖苷、东莨菪内酯、五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素同时进行测定，对处方中党参、黄芪（蜜炙）、桑白皮（蜜炙）、紫菀四味药材通过薄层色谱进行鉴别，对于补肺丸药品中6种药材质量的全面控制，以及对改进和提高补肺丸药品的质量标准具有一定的参考意义和实用价值。
1 仪器与试药Agilent 1200高效液相色谱仪（安捷伦公司）；DAD检测器，带四元洗脱泵，全自动进样器，BSA124-CW型电子天平（赛多利斯公司），KG-300DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），硅胶G薄层色谱板（Merk公司）。
补肺丸（甘肃省西峰制药有限责任公司，每丸重9 g），批号：712094、710039、710056、710072、711066、712083。桑白皮对照药材（批号1124-200007）和对照品紫菀酮（批号111888-201001）、党参炔苷（批号111732-201607）、黄芪甲苷（批号110781-201314，供鉴别使用）、毛蕊花糖苷（批号111530-201310，含量≥93.3%）、东莨菪内酯（批号110768-200504）、五味子醇甲（批号110857-201714，含量≥99.9%）、五味子甲素（批号110764-200005，含量≥99.3%）、五味子乙素（批号110765-200205，含量≥99.0%，供含量测定使用），均购于中国食品药品检定研究院；乙腈为色谱纯，水为娃哈哈纯净水，磷酸、正丁醇、三氯甲烷、冰醋酸、乙酸乙酯等试剂均为分析纯（上海国药化学试剂公司）。
2 方法与结果 2.1 TLC鉴别 2.1.1 紫菀取上述3个不同批号的补肺丸样品9.0 g，剪碎，加适量的硅藻土研匀，加甲醇25 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液；另取紫菀酮对照品2.0 mg，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（通则0502）试验，吸取上述供试品溶液和对照品溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚（60~90℃）-乙酸乙酯（9:1）为展开剂，展开12 cm，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰，分别在日光和紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，日光下显相同颜色的浅黄色斑点；紫外光下显相同颜色的蓝白色斑点，阴性无干扰。见图 1。
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1.阴性样品（negative sample）S.对照品（reference substance）3~5.样品（sample） A.日光（visible light）B. 365 nm 图 1 紫菀薄层色谱图 Fig.1 TLC chromatograms of Asteris Radix et Rhizoma |
取上述3个不同批号的补肺丸样品9.0 g，剪碎，加适量的硅藻土研匀，加饱和的碳酸氢钠溶液25 mL，超声处理30 min，滤过，滤液用乙酸乙酯振摇提取2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，水浴蒸干，残渣加甲醇1 mL作为供试品溶液；另取桑白皮对照药材1.0 g，加饱和的碳酸氢钠溶液15 mL，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法（通则0502）试验，吸取上述2种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-丙酮（15:1）为展开剂，展开12 cm，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的蓝紫色斑点，阴性无干扰。见图 2。
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1~3.样品（sample）4.对照药材（reference material）5.阴性样品（negative sample） 图 2 桑白皮薄层色谱图（365 nm） Fig.2 TLC chromatogram of Mori Cortex(365 nm) |
取上述3个不同批号的补肺丸样品9.0 g，剪碎，加适量的硅藻土研匀，加甲醇50 mL，加热回流1 h，滤过，滤液蒸干，残渣加水20 mL使溶解，通过D101型大孔吸附树脂柱（内径为1.5 cm，柱高为15 cm），先用水50 mL洗脱，弃去水液，再用50%乙醇80 mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液；另取党参炔苷对照品适量，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（通则0502）试验，吸取上述2种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-水（7:1:0.5）为展开剂，展开12 cm，供试品色谱中，日光下，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的浅棕色斑点；置紫外光灯（365 nm）下检视。显相同颜色的荧光斑点。阴性无干扰。见图 3。
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1~3.样品（sample）S.对照品（reference substance）4.阴性样品（negative sample） A.日光（visible light）B. 365 nm 图 3 党参薄层色谱图 Fig.3 TLC chromatograms of Codonopsis Radix |
取上述3个不同批号的补肺丸样品9.0 g，剪碎，加适量的硅藻土研匀，加甲醇50 mL，加热回流1 h，滤过，滤液蒸干，残渣加水20 mL使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次25 mL，用正丁醇饱和的氨试液洗涤2次，每次25 mL，弃去正丁醇饱和的氨试液，正丁醇液蒸干，残渣加水10 mL溶解，通过D101型大孔吸附树脂柱（内径为1.5 cm，柱高为15 cm），先用水50 mL洗脱，弃去水液，再用30%乙醇水50 mL洗脱，弃去洗脱液，接着再用70%乙醇水100 mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液；另取黄芪甲苷对照品2.0 mg，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液。照薄层色谱法（通则0502）试验，精密吸取上述2种溶液各5 μL，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水（13:7:2，下层）溶液为展开剂，展开12 cm，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，日光下显相同的棕褐色斑点，紫外光灯365 nm下显相同颜色的橙黄色荧光斑点，阴性无干扰。见图 4。
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1~3.样品（sample）S.对照品（reference substance）4.阴性样品（negative sample） A.日光（visible light）B. 365 nm 图 4 黄芪薄层色谱图 Fig.4 TLC chromatograms of Astragali Radix |
Agivlent-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸水（B），梯度洗脱（0~5 min，15%A→25%A；5~20 min，25%A→26%A；20~30 min，26%A→40%A；30~40 min，40%A→46%A；40~41 min，46%A→55%A；41~71 min，55%A→63%A；71~75 min，63%A）；流速1.0 mL·min-1；柱温30 ℃；检测波长0~30 min（334 nm），30~75 min（215 nm）；进样量：10 μL；在此色谱条件下进样测定，理论塔板数均大于8 000，分离度均大于1.5，色谱图见图 5。
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1.毛蕊花糖苷（acteoside）2.东莨菪内酯（scopoletin）3.五味子醇甲（schisandrin）4.五味子甲素（deoxyschizandrin）5.五味子乙素（γ-schisandrin） 图 5 混合对照品（A）、供试品（B）和缺熟地黄（C）、缺桑白皮（D）、缺五味子（E）的阴性样品的HPLC图 Fig.5 HPLC chromatograms of mixed reference substances(A), sample(B), negative sample without Rehmanniae Radix Praeparata(C), negative sample without Mori Cortex(D)and negative sample without Schisandra Chinensis Fructus(E) |
精密称取对照品毛蕊花糖苷5.60 mg、东莨菪内酯7.52 mg、五味子醇甲7.31 mg、五味子甲素4.75 mg、五味子乙素11.92 mg，分别置10 mL量瓶中，分别加甲醇稀释至刻度，作为对照品储备液。分别精密吸取上述毛蕊花糖苷对照品储备液1 mL，东莨菪内酯对照品储备液1 mL，五味子醇甲对照品储备液5 mL，五味子甲素储备液5 mL和五味子乙素储备液3 mL，置同一25 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，作为混合对照品溶液（每1 mL含毛蕊花糖苷22.40 μg，东莨菪内酯30.08 μg，五味子醇甲146.20 μg，五味子甲素95.00 μg，五味子乙素143.04 μg）。
2.2.3 供试品溶液的制备取批号为712094的补肺丸样品剪碎混匀，精密称定9.0 g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，称量，超声（频率270 W，功率40 kHz）处理30 min，放冷，再称量，用甲醇补足减失的量，摇匀，用0.45 μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
2.2.4 阴性样品溶液的制备按照补肺丸的处方工艺和处方量的1/10，分别制备缺熟地黄、桑白皮（蜜炙）和五味子药材的阴性样品，按“2.2.3”项下供试品溶液的制备方法，同法制成阴性样品溶液。按照“2.2.1”项下的色谱条件，分别进样上述对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液，记录色谱图，结果表明阴性样品对毛蕊花糖苷、东莨菪内酯、五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素的色谱峰无干扰。
2.2.5 线性关系考察精密吸取“2.2.2”项下混合对照品溶液1、2、5、10、25 μL注入液相色谱仪，按照“2.2.1”项下色谱条件测定峰面积，以进样量的质量（μg）为横坐标，各色谱峰的峰面积为纵坐标进行线性回归，结果见表 1。
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表 1 5个成分的回归方程，相关系数及线性范围 Tab.1 Results of regression equation, correlation coefficient and linear range |
取“2.2.2”项下的混合对照品溶液，按照“2.2.1”项下的色谱条件，进样10 μL，连续进样6次，记录各对照品的色谱峰面积，结果毛蕊花糖苷、东莨菪内酯、五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素峰面积的RSD分别为0.25%、0.21%、0.18%、0.36%和0.42%，表明仪器的精密度良好。
2.2.7 稳定性试验取“2.2.3”项下制备的供试品溶液，分别在0、1、2、4、8、12、24 h进样10 μL测定，连续考察24 h，记录各成分的色谱峰面积，结果毛蕊花糖苷、东莨菪内酯、五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素峰面积的RSD分别为1.2%、1.9%、0.67%、1.0%和0.96%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
2.2.8 重复性试验取批号712094的补肺丸样品9.0 g，按照“2.2.3”项下的方法同时制备6份供试品溶液，按照“2.2.1”项下的色谱条件进样测定，结果毛蕊花糖苷、东莨菪内酯、五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素的平均含量分别为0.051 6、0.082 6、0.288 3、0.050 9、0.159 6 mg·g-1，RSD分别为1.2%、1.1%、0.51%、0.36%和0.72%，表明该方法重复性良好。
2.2.9 加样回收率试验精密称取已知含量的补肺丸（批号712094）样品6份，精密量取“2.2.2”项下毛蕊花糖苷、东莨菪内酯、五味子甲素、五味子乙素的对照品储备液各5 mL，分别置10 mL量瓶中，制成每1 mL含毛蕊花糖苷0.261 2 mg、东莨菪内酯0.376 0 mg、五味子甲素0.235 8 mg、五味子乙素0.590 0 mg的溶液；另精密称取五味子醇甲对照品约1.30 mg，共6份，分别精密加入五味子醇甲对照品和上述对照品各1 mL于供试品溶液中，按照“2.2.3”项下方法制备供试溶液，按照“2.2.1”项下的液相色谱条件进样测定，分别计算毛蕊花糖苷、东莨菪内酯、五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素的回收率，结果见表 2。
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表 2 5个成分的加样回收率结果（n=6） Tab.2 Results of recoveries of five components |
取6个不同批号的补肺丸样品，按照“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，每批样品平行制备2份，按照“2.2.1”项下色谱条件进行测定，按照外标法分别计算6批样品中毛蕊花糖苷、东莨菪内酯、五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素的含量，结果见表 3。
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表 3 补肺丸中5个成分含量测定结果（n=2，mg·g-1） Tab.3 The contents of five components in Bufei pills |
本实验主要通过桑白皮对照药材来鉴别处方中的桑白皮，采用与供试品相同的提取方法进行对照药材的制备。首先采用2015年版《中华人民共和国药典》一部桑白皮鉴别项下的醋酸作为展开剂[15]，采用聚酰胺薄层板点样，结果发现分离效果不好，斑点拖尾模糊；接着采用石油醚（60~90 ℃）-乙酸乙酯（3:2）作为展开剂，结果发现分离依然不好；最后采用甲苯-丙酮（15:1）作为展开剂，分离较好，斑点明显，阴性无干扰。
3.2 供试品溶液的制备实验采用正交实验L9（33）对供试品溶液的制备方法进行考察，分别考察不同的提取溶剂（甲醇、50%甲醇水、稀乙醇）、不同超声功率（140、280、420 W）和不同超声提取时间（20、30、40 min）的影响，结果发现超声功率有显著性影响，超声提取时间有不显著影响，最后确定以甲醇为提取溶剂，超声功率280 W，超声30 min作为供试品溶液的最佳制备方法。
3.3 流动相的选择分别采用乙腈-0.1%醋酸水、乙腈-0.1%甲酸水和0.2%磷酸水等作为流动相，由于实验中所测五味子的3个成分最大吸收选择215 nm，甲酸和乙酸在低波长下会有紫外吸收，且具有一定的挥发性，测定时间过长时流动相的pH会发生变化，影响保留时间，磷酸挥发性差，且低波长下吸收小，不会有干扰，结合预实验中的多次实验，最后采用乙腈-0.2%磷酸水等作为流动相，各色谱峰分离良好，理论塔板数高，峰形对称，阴性无干扰。
3.4 波长的选择采用DAD在400~200 nm范围内进行全波长扫描，并结合所测成分的最大光谱图进行比较分析：毛蕊花糖苷的最大吸收波长为334 nm；东莨菪内酯的最大吸收波长为344 nm，东莨菪内酯在334 nm与344 nm波长下峰面积基本一致，影响不大；五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素都在250 nm与215 nm处有最大吸收，但是发现在215 nm下三者的峰面积增大较多，五味子醇甲峰面积增大4.8倍，五味子甲素峰面积增加3.5倍，五味子乙素峰面积增加5.8倍。综合考虑，决定在334 nm波长下测定毛蕊花糖苷和东莨菪内酯，215 nm波长下测定五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素，以保证测定的灵敏度最高。
3.5 小结本实验首先采用液相色谱法对方中六味药的主要成分进行含量测定，结果发现效果不是很理想，液相色谱很难同时测定所有成分，尤其皂苷类黄芪甲苷和党参中党参炔苷等主要活性成分，故建立薄层色谱对处方中党参、黄芪（蜜炙）、桑白皮（蜜炙）、紫菀四味药材进行鉴别，以期进行其质量标准的改进。同时对方中熟地黄、桑白皮、五味子3种药材中的指标成分毛蕊花糖苷、东莨菪内酯、五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素5个成分同时进行测定，比文献报道的测定单一成分更全面，方法学验证实验结果表明，所建立的方法操作简单，结果准确，专属性强，可以为提高和改进补肺丸的质量标准提供实验依据。
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