注射用盐酸甲氯芬酯为苯氧乙酸酯类中枢兴奋药，用于治疗外伤性昏迷、酒精中毒、儿童遗尿症等^[1-4]。工业化生产盐酸甲氯芬酯主要以对氯苯氧乙酸为起始原料，与N，N-二甲氨基乙醇反应生成甲氯芬酯，然后成盐、结晶制得^[5-6]。盐酸甲氯芬酯在水和醇溶液中极易降解，产生大量杂质^[7]，且同时等比例生成胆碱类物质，后者具有刺激性，注射时可能导致明显的血管刺激反应^[8]，因此，有关物质为其关键质控点。虽然胆碱类杂质毒性较高，但该类杂质无紫外吸收，不适合用常规检测器进行测定，故可根据杂质降解机理，通过控制水解和醇解杂质的含量，来保障产品质量及临床用药的安全有效。

目前该品种的有关物质检查执行《中华人民共和国药典》2015年版标准^[9]，国外药典仅日本药局方收载其原料药标准^[10]，且无有关物质项检查。现行标准采用HPLC等度洗脱法，流动相中有机相比例较低且分析时间较短，有强保留杂质未能检出的风险。国外药典均未收载该品种。已有报道的注射用盐酸甲氯芬酯有关物质测定方法多为高效液相色谱法^[11-12]，但在流动相的选择上未考虑样品在醇中极易降解和在C₁₈柱中无保留的情况，且均未检出醇解杂质。

本文采用HPLC技术，建立了注射用盐酸甲氯芬酯有关物质检查新方法，检测出现行标准中未能检出的新杂质。应用该方法，对66批注射用盐酸甲氯芬酯仿制药进行考察，对产品质量进行评价，保障了临床用药安全，为科学监管提供了有力的支撑，对注射剂仿制药质量一致性评价起到积极引导和示范作用。

1 实验部分 1.1 仪器与试药

岛津20A高效液相色谱仪（Shimadzu公司，含LC-20AB泵，SIL-20ACHT自动进样器，SFD-M20A二极管阵列检测器，CTO-20AC柱温箱，Shimadzu LC solution工作站），Milli-Q纯水机（Merck millipore公司），十万分之一电子天平（赛多利斯天平公司）。

盐酸甲氯芬酯对照品（含量99.7%）购自中国食品药品检定研究院；杂质对照品对氯苯氧乙酸（含量99.0%，批号05621LT-1）购自北京百灵威科技有限公司。乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

66批注射用盐酸甲氯芬酯样品均来源于国家评价性抽验。辅料甘露醇由青岛明月海藻集团有限公司提供。

1.2 色谱条件

采用资生堂MG-Ⅱ C₁₈（4.6 mm×150 mm，5 μm）色谱柱，流动相为0.05 mol·L^-1辛烷磺酸钠溶液（磷酸调节pH至2.5）-乙腈（65:35），流速为1.0 mL·min^-1，柱温为25 ℃，检测波长为225 nm，进样量10 μL，分析时间为主成分峰保留时间的4倍。

2 结果与讨论 2.1 色谱条件优化

本研究针对现行有关物质检查方法中，等度洗脱条件下有机相比例低且分析时间短，不利于强保留杂质检出的问题，对色谱系统进行优化，发现在规定的分析时间后有一较大色谱峰被洗脱（杂质C），如图 1所示。前期对盐酸甲氯芬酯杂质谱的研究结果表明：杂质A为甲氯芬酯水解产物，为高频出现的主要杂质；杂质B为甲醇中降解产物，仅在1家企业样品中检出；杂质C为甲氯芬酯与乙醇反应产生的降解产物，与盐酸甲氯芬酯的合成工艺相关^[5]，且在现行药典标准规定的检测时间内无法有效检出。

为进一步考察色谱系统对杂质的分离情况，进行了梯度洗脱，在5%~95%的有机相比例下，未能检出除杂质C外的新杂质，考虑到梯度洗脱需要一定的平衡时间，且等度洗脱时间较短，因此确定使用等度洗脱条件。在等度洗脱条件下，分别考察了有机相比例和缓冲液pH对系统分离情况的影响。

将流动相中有机相比例由标准规定的35%升高至40%，杂质C出峰时间略有提前，但主峰与水解产物（杂质A）峰的分离度由35%比例的9.8降至40%比例的3.1，在专属性研究中氧化破坏下的主峰与相邻杂质峰难以分离。因此，兼顾分离度要求，确定等度洗脱条件为有机相比例35%。

在确定有机相比例的基础上，考察了不同pH缓冲液体系对分离能力的影响。甲氯芬酯的pKa为8.17，在pH约6.7以下都以离子形式存在，且在弱酸条件下稳定，水溶液pH大于5.0时水解迅速。因此，在0.05 mol·L^-1辛烷磺酸钠（磷酸调pH分别至2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5和6.0）-乙腈（65:35）等度洗脱条件下对降解溶液的分离情况进行考察。由分离结果可知，不同pH缓冲液对杂质峰个数无影响，主成分和杂质C的保留时间在pH 2.0~6.0内变化较小（RSD小于1.0%），但是杂质A峰形及出峰时间受pH影响较大。缓冲液pH小于4.0时，杂质A出峰时间变化较小（相对保留时间为0.4~0.6）；当pH大于等于4.0时，杂质A出峰时间显著提前（相对保留时间为0.1~0.2），且峰形分叉。综合考虑，选择缓冲液pH为2.5。

根据考察结果，兼顾分离度、峰形和样品稳定性等因素，最终新建立的HPLC方法中，选择缓冲液pH为2.5，有机相比例35%的等度洗脱条件，并延长分析时间至主成分保留时间的4倍。

2.2 方法学验证 2.2.1 耐用性考察

取盐酸甲氯芬酯适量，用水-甲醇-无水乙醇（4:2:12）的混合溶液溶解并稀释成含盐酸甲氯芬酯1 mg·mL^-1的溶液，在100 ℃水浴10 min，作为降解溶液，用于方法耐用性的考察。考察了本方法在SHISEIDO、Agilent、Phenomenex、GL Sciences、Thermo 5个品牌6个不同规格的色谱柱中的耐用性。结果如表 1所示，各主要杂质峰均能有效分离，其中杂质C相对保留时间在2.6~3.6之间，所用6根色谱柱的各项指标均符合系统适用性要求。

2.2.2 专属性考察

注射用盐酸甲氯芬酯的制剂工艺分为原料药直接分装和冷冻干燥2种，后者含有辅料甘露醇。本研究按照含辅料比例最高的处方，取甘露醇适量，加水溶解作为空白辅料溶液。空白辅料溶液的色谱图与溶剂色谱图基本一致，未显示明显的辅料峰，对主成分测定没有干扰。在强制破坏试验中，经酸、碱、氧化、光照破坏后（图 2），各破坏条件下相邻杂质与主峰分离度均符合要求，主峰纯度因子均大于999，说明系统具有良好的专属性。

2.2.3 稳定性考察

经考察，主成分在8 h内稳定（主成分峰面积的RSD为0.26%，小于20%），但杂质含量仍呈明显上升趋势。以杂质变化的绝对值小于0.05%计算，应在4 h内完成测定，故供试品溶液应临用新制。

2.2.4 检测下限

在主峰与噪音强度比大于3时，盐酸甲氯芬酯检测下限为1 ng，杂质A和杂质C检测下限分别为0.2 ng和1.4 ng。

2.3 样品测定及质量评价

采用新建的HPLC方法对9家企业66批次样品进行有关物质检查，单个最大杂质均为水解杂质A，且在所有批次样品中均有检出，含量为0~1.1%；在1家企业的14批样品中发现并检测出杂质C，含量为0.1%~0.2%；样品中所有杂质总量为0~1.1%。

考察发现，有关物质不合格样品均为冷冻干燥工艺生产的制剂，且冻干工艺生产的样品中杂质A含量（均值0.34%）显著高于无菌分装工艺生产的样品（均值0.05%），说明样品中杂质A主要由冻干工艺中水解产生。此次考察的9家企业中，有4家采用冷冻干燥工艺，有关物质检测不合格样品涉及其中2家企业生产的3批样品，提示少数企业的冷冻干燥工艺水平仍有较大差距，需要进一步改进。

前期研究结果表明，杂质C为原料药合成工艺中引入，是酸性条件下甲氯芬酯与无水乙醇的酯交换产物^[13]。为了进一步证实杂质C与乙醇的相关性，本研究采用气质联用法测定样品中的乙醇量^[14]，并从检出杂质C的企业中选取7批样品对杂质C的含量和乙醇量（表 2）进行相关性分析（表 3），结果表明杂质C的含量与乙醇量显著正相关（P < 0.05），进一步说明杂质C源于主成分与溶剂无水乙醇发生的酯交换反应，建议在原料药精制纯化过程中应避免使用低级醇类试剂，且使用无水乙醇做溶剂时，应合理控制生产工艺以减少杂质C的生成。

3 结论

本研究对注射用盐酸甲氯芬酯现行标准中的有关物质测定方法进行了考察及优化，在此基础上建立的新方法灵敏度高，专属性强，操作简便，可有效检出现行标准未能检出的醇解杂质，为《中华人民共和国特典》2015年版中注射用盐酸甲氯芬酯质量标准的修订提供了参考。通过研究，还确认了注射用盐酸甲氯芬酯高风险杂质及质量控制关键步骤，指导企业优化相应的生产工艺，提升了产品质量，为科学监管提供技术保障和执法依据，促进了国产仿制药质量的不断提高，为一致性评价工作提供了有力的技术支撑。