2019, Vol. 39 
吲哚类生物碱是具有吲哚分子骨架的一类生物碱[1]，主要分布在马钱子科、夹竹桃科和茜草科，在芸香科、苦木科等植物中亦有存在。这类生物碱数目很多，据不完全统计，已超过1 200多个，其结构一般都比较复杂，且具有显著或重要的生物活性[2]。吲哚类生物碱临床一般用于抗肿瘤、中枢神经兴奋、降压、强心等[3-7]，其中士的宁、去氢吴茱萸碱、硫酸长春碱、利血平是4个来源于不同类型的吲哚类生物碱，其结构式见图 1。
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图 1 士的宁、去氢吴茱萸碱、硫酸长春碱、利血平的化学结构式 Fig.1 Chemical structures of strychnine, dehydroevodiamine, vinblastine sulfate and reserpine |
目前，分析测定吲哚类生物碱的方法有高效液相色谱法(HPLC)、薄层色谱法(TLC)、毛细管电泳法(GE)、比色法等。其中HPLC法应用的比较多[8-9]，但由于生物碱结构中碱性氮原子与固定相未键合酸性硅醇基的相互作用，使得该方法存在色谱峰的展宽、拖尾、漂移，对称性和重现性差，分离效能低，分析时间长等缺点[10]。为了解决这些问题，一般会在流动相中加入烷基胺、烷基磺酸盐、三乙胺或醋酸铵等添加剂，峰形可以得到一定的改善，但给色谱柱带来了不可逆转的伤害[11]。离子液体作为一种环境友好的溶剂，由于其具有熔点低、导电性好、蒸气压低、溶解性好等独特性能，被广泛应用于现代医药化工领域[12]。当离子液体作为液相色谱分离的流动相添加剂时，能显著提高碱性组分的分离效果，抑制碱性分析物的拖尾，其作用机理可能是离子液体可以抑制未封闭的硅烷醇的作用，并且其抑制能力大大强于传统的三乙胺、烷胺类和烷基磺酸盐等添加剂[10]。近年来，将离子液体作为流动相添加剂用于反相液相色谱的研究日益增多，并取得了一定成果[13-14]，目前，以咪唑类离子液体的应用最广泛[15]。本实验将咪唑类离子液体作为高效液相色谱流动相添加剂，考察了分离条件对士的宁、去氢吴茱萸碱、硫酸长春碱和利血平4个吲哚类生物碱色谱行为的影响，根据溶质计量置换保留模型(SDM-R)以及相关参数，初步探讨了分离机理，以期为吲哚类生物碱的分离测定提供新思路。
1 实验部分 1.1 仪器与试药Agilent1260型高效液相色谱仪(Agilent公司)；MS105Du十万分之一天平(METTLER TOLEDO)；KQ-250DE型数控超声波清洗器(江苏省昆山市超声仪器有限公司)；PHS-25 Ph Meter计(上海霄盛仪器制造有限公司)；FY-1H型旋片式真空泵(浙江飞越机电有限公司)。
对照品士的宁(批号0705-200005，含量≥99%)、硫酸长春碱(批号420038-201601，含量≥99%)、利血平(批号100041-201814，含量100%)，均购于中国食品药品检定研究院；对照品去氢吴茱萸碱(批号Q-068-170426，含量 > 98%)、1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐(C4minBF4，含量97%)、1-己基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐(C6minBF4，含量97%)、1-辛基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐(C8minBF4，含量98%)、1-丁基-3-甲基咪唑氯化盐(C4minCl，含量≥97%)、1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐(C4minPF6，含量97%)，均购于上海源叶生物科技有限公司；乙腈和甲醇为色谱纯；磷酸、三乙胺、氢氧化钠、三氯甲烷均为分析纯；水为娃哈哈水。
1.2 混合对照品溶液的配制精密称取对照品去氢吴茱萸碱10.16 mg和士的宁9.32 mg，分别置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释到刻度；精密称取硫酸长春碱对照品5.14 mg，置10 mL量瓶中，加1 mL水溶解，再用甲醇定容至刻度；精密称取利血平对照品13.36 mg，置10 mL量瓶中，加1 mL三氯甲烷溶解，再用甲醇定容至刻度；得4个吲哚类生物碱的对照品储备液，各精密量取5 mL，置25 mL量瓶中，甲醇定容并摇匀，即得。保存于冰箱，使用前放置至室温后过0.45 μm滤膜。
1.3 色谱条件色谱柱：Diamonsil Plus-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-0.1%磷酸水溶液梯度洗脱，pH 3.0；检测波长242 nm(参比波长296 nm)；流速1.0 mL·min-1；柱温：30 ℃；进样体积10 μL。另向缓冲液中加入3.0 mmol·L-1的离子液体(C4minCl)为添加剂。流动相梯度程序见表 1。
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表 1 流动相梯度程序 Tab.1 Gradient elution program of mobie phase |
通过光谱全波长扫描发现，士的宁、硫酸长春碱和利血平在检测波长为242 nm，参比波长为360 nm处均有较大吸收，而去氢吴茱萸碱在检测波长为370 nm，参比波长为360 nm处有最大吸收。再通过等吸收线图发现当选用参比波长为296 nm时，4个吲哚类生物碱在242 nm波长处均有较大吸收。
2.2 有机相的选择分别考察相同有机相比例下甲醇和乙腈对生物碱分离效果的影响。结果发现，相比于乙腈，用甲醇做有机相，4个吲哚类生物碱的出峰时间延后，且峰形较差，因此本实验选用乙腈为有机相。
2.3 离子液体与三乙胺的比较依照上述色谱条件，得4个吲哚类生物碱的分离效果，如图 2所示。由图 2可得：向流动相中加入添加剂，能明显改善吲哚类生物碱的分离效果，可以抑制拖尾峰的产生并缩短出峰时间；C4mimCl效果明显优于三乙胺。
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1.士的宁(strychnine) 2.去氢吴茱萸碱(dehydroevodiamine) 3.硫酸长春碱(vinblastine sulfate) 4.利血平(reserpine)
A.无添加剂(no additives) B. 3.0 mmol·L-1 TEA流动相作添加剂(3.0 mmol·L-1 TEA as mobile phase additive) C. 3.0 mmol·L-1 C4mimCl流动相作添加剂(3.0 mmol·L-1 C4mimCl as mobile phase additive) 图 2 吲哚类生物碱的液相分离色谱 Fig.2 Chromatograms of indole alkaloids |
为了选择合适的离子液体，考察了在相同的摩尔浓度下5种不同的离子液体作流动相添加剂对吲哚类生物碱的分离情况，并考察不同烷基链长度的阳离子和不同离液序列的阴离子对吲哚类生物碱分离的影响。结果发现，当阳离子(C4mim+)相同时，保留时间随着离液序列的升高而增大(PF6- > BF4- > Cl-)；当阴离子(BF4-)相同时，随着阳离子组分的烷基链的增长，保留时间减小，色谱峰拖尾被有效地抑制，但当烷基链增长到一定长度时，部分吲哚类生物碱成分会产生峰前沿现象，且随着烷基链长度的增加，离子液体越容易产生噪音，对基线的干扰越严重；另外，随着烷基链长度的增加，其黏度也不断增加，导致系统平衡时间延长，柱效有所降低，对色谱系统和色谱柱有所损伤。具体色谱参数见表 2。为了更好的分离度、更短的分析时间和较好的峰形，本实验选择C4minCl离子液体作为流动相的添加剂。
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表 2 不同离子液体对4个吲哚类生物碱的保留时间(tR)、理论塔板数(N)、对称因子(fs)3种色谱参数的影响 Tab.2 Effects of various ionic liquids on chromatographic parameters, including retention time (tR), number of efficient plates (N) and symmetry factor (fs) of four indole alkaloids |
离子液体阴阳离子组分的协同作用使其作为流动相添加剂具有独特的性质。对于阴离子来说，越高的离液序列，越易与吲哚类生物碱生成中性离子对，从而使组分在色谱柱上的保留时间增加；对于阳离子组分来说，由于其侧链的烷基和分析物产生疏水作用，增强了流动相的洗脱能力，并且能够通过静电作用覆盖裸露的硅羟基，抑制峰的拖尾。
2.5 离子液体C4minCl浓度的影响以一系列不同浓度(1.0、1.6、3.0、4.0、5.0 mmol·L-1)的C4minCl作为流动相添加剂，分析士的宁、去氢吴茱萸碱、硫酸长春碱和利血平4个吲哚类生物碱，实验结果表明，离子液体的浓度对分析物的保留和峰形有显著影响(见图 3)。随着C4minCl浓度的增加，保留时间呈减小趋势以及4个吲哚类生物碱的色谱峰拖尾被有效地抑制，主要是因为离子液体的添加，咪唑阳离子和分析物的极性基团对硅烷固定相表面的裸露的硅羟基产生竞争吸附和高浓度的离子液体具有排斥和疏水作用。但当浓度增加到3 mmol·L-1时，对称因子增加较缓慢，且随着浓度的增加，流动相黏度增大，导致平衡时间延长，因此，本实验选定C4minCl浓度为3 mmol·L-1。
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1.士的宁(strychnine) 2.去氢吴茱萸碱(dehydroevodiamine) 3.硫酸长春碱(vinblastine sulfate) 4.利血平(reserpine) 图 3 C4minCl浓度对组分保留因子(lgk’)和对称因子(fs)的影响 Fig.3 Effects of C4minCl concentrations on the retention factors (lgk') and symmetry factor (fs) |
另外，根据SDM-R，考察了离子液体浓度对数与保留因子对数之间的关系，探讨了离子液体作用机理。其中SDM-R的简化数学表达式为：lgk'=lgI-ZlgαD，式中，k'表示保留因子，αD表示置换剂的活度(将离子液体设为置换剂时，即用离子液体浓度表示)，lgI和Z为常数。
实验结果表明，lgk'~lgαD的线性关系良好，4个成分保留值的对数与离子液体浓度对数均呈线性关系，士的宁、去氢吴茱萸碱、硫酸长春碱和利血平的相关系数(R2)分别为0.923 1、0.981 1、0.984 5、0.956 6。可知C4minCl浓度与保留因子的变化符合SDM-R，且保留过程以竞争吸附为主。
2.6 离子液体C4minCl溶液pH的影响在反相色谱中，可离子化的分析物的保留时间与其离子化程度密切相关，pH也直接影响离子化合物存在形式。因此，在其他色谱条件相同的情况下且在色谱柱允许的pH范围内(pH 2.0~8.0)，考察了流动相pH(2.0、3.0、5.0、6.0、7.0、8.0)与分析物保留因子k’的关系。
为了更好地弄清流动相pH与分析物保留因子k'的关系，把保留因子的变化对pH作图(见图 4)，将k'的变化趋势展现得更加清楚。从图中可以看到，随着pH的增加，k'呈增长的趋势，说明pH的变化会引起流动相洗脱能力的变化，主要是因为C4minCl作为电解质，在流动相中可以被水解为C4min+和Cl-。Cl-可以破坏分析物周围的水分子层，提高分析物的保留，从而降低洗脱能力。pH的下降使Cl-逐渐转化为HCl，而以分子的形式存在时，破坏分析物周围水分子层的能力下降，分析物的保留因子也将减小。由图 4可知，在pH 2~4范围内，k'变化较微弱，分析时间较短，且峰形较好，因此本实验C4minCl溶液的pH被选定为3.0。
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1.士的宁(strychnine) 2.去氢吴茱萸碱(dehydroevodiamine) 3.硫酸长春碱(vinblastine sulfate) 4.利血平(reserpine) 图 4 C4minCl溶液pH对保留因子(k’)的影响 Fig.4 Effects of C4minCl solution pH on the retention factors (k') |
本文以离子液体C4minCl为反相高效液相色谱流动相添加剂，建立了士的宁、去氢吴茱萸碱、硫酸长春碱和利血平的分离分析方法，考察了各种影响因素，并与传统的流动相添加剂进行比较，建立了相关的色谱分离模型，初步探讨了离子液体作用机理和分离效能。实验结果表明，以离子液体作为流动相添加剂时，4个吲哚类生物碱的色谱峰形得到了较好改善，保留时间减小，分离效能提高，在分离过程中，离子液体浓度与保留因子在SDM-R中线性拟合较好，其主要作为置换剂，与被分离组分的作用以竞争吸附为主。
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