随着《药品生产质量管理规范》（2010年修订）（以下简称“GMP”）和《中华人民共和国药典》（2015年版）的相继推行实施，药品生产的质量管理水平已被提升到了新的高度，药品GMP车间微生物监控也备受重视和关注^[1]。近年来，“欣弗事件”、“刺五加事件”等微生物污染药品的事件仍有发生，对公众用药安全构成严重的威胁^[2-3]。因此，对药品生产、检测环境及过程中微生物种类及分布的研究，建立药品生产及检测环境中微生物信息库，将有助于药品GMP企业采取合适的消毒灭菌、过程分析措施控制药品，特别是无菌药品生产中的微生物污染，提高药品质量，为可能发生的、上市后药品微生物污染药害事件的溯源分析、无菌检查“一次性检验”及应急处理提供技术依据。对保障公众用药安全、有效，有着重大意义。

本试验从药品注射剂生产企业GMP车间及其周围环境易受微生物污染的各个关键部位采集样本，结合微生物生化鉴定等方法，建立药品GMP生产企业微生物信息库，指导药品GMP企业实现有效的微生物管理。

1 材料与方法 1.1 材料

胰酪大豆胨液体培养基及胰酪大豆胨琼脂培养基均购自北京奥愽星生物有限公司。

VITEK2 Compact自动微生物快速检测分析系统（法国生物梅里埃公司）；Phoenix-100全自动细菌鉴定仪（美国海净纳（原美国杜邦）公司）

1.2 方法 1.2.1 质控菌株鉴定

取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽胞杆菌和大肠埃希菌的1代培养物接种至胰酪大豆胨琼脂培养基，于30~35 ℃培养18 h，刮取菌苔用Phoenix-100全自动细菌鉴定仪和VITEK2Compact自动微生物快速检测分析系统进行菌种鉴定，参数设置培养温度为36 ℃，菌液浊度为0.5麦氏浊度（MCF）。

1.2.2 样品的采集

根据GMP车间、周围环境的房间数量和面积，对所有可能影响到产品质量和易受微生物污染的关键部位进行微生物样本采集。同时采集生产人员、设备等生产环节的微生物样本。

主要采集2016—2018年的人员及设备表面微生物、沉降菌、浮游菌共345株，每个季度采集1次。①人员：采用压指试验、表面接触（头、胸、手腕、肘、膝盖）平皿；②设备：表面擦拭；③环境：沉降菌（A级、B级、C级、D级）、浮游菌（A级、B级）^[4-7]。将所有的平皿置于30~35 ℃培养不少于3 d。

1.3 环境微生物菌型检测

将所培养的单菌落进行划线分离，得到的单菌落转接营养肉汤置-80℃冷冻保存。同时进行菌落形态观察，并进行革兰染色，根据染色结果选择后继菌种鉴定需要的是阳性还是阴性鉴定卡。然后按照VITEK2 Compact自动微生物快速检测分析系统或Phoenix-100全自动细菌鉴定仪说明书中的标准操作流程进行测定，一般2~10 h给出鉴定结果。其中在Phoenix-100全自动细菌鉴定仪上同时进行细菌药敏性试验。

菌种鉴定实验过程：（1）将分离纯化的新鲜菌苔用无菌棉拭子加入到相应的菌种鉴定用培养液中，调节麦氏浓度到0.5，并混匀。（2）将菌液从菌种鉴定卡上端的加样口缓慢加入。（3）扫描菌种鉴定卡后面的条码，仪器自动识别后装入仪器，开始运行，实验结束后，读取报告。

药敏试验过程：（1）使用之前，把药敏指示剂溶液添加到药敏培养液试管中并保存在黑暗中达8 h。只用1滴从滴瓶自由落下的药敏指示剂溶液。（2）将分离纯化的新鲜菌苔用无菌棉拭子加入到相应的菌种鉴定用培养液中，调节麦氏浓度到0.5，并混匀。（3）用移液枪吸取25 μL上述菌液加入到药敏培养液试管中。（4）将菌液从菌种鉴定及药敏鉴定卡上端的加样口缓慢加入。（5）扫描菌种鉴定卡后面的条码，仪器自动识别后装入仪器，开始运行，实验结束后，读取报告。

2 结果 2.1 质控菌株检测结果

用VITEK2 Compact自动微生物快速检测分析系统或Phoenix-100全自动细菌鉴定仪生物检测系统对上述已知的金黄色葡萄球菌等共4株标准菌株作为质控菌株进行检测，结果与设定的标准菌株完全相符，可信度在98%以上，见表 1。

2.2 环境微生物鉴定结果

通过对所收集的环境菌共样本345个样品检测结果进行整理和分析。检出的微生物115株（其中人员及设备表面微生物4株，浮游菌6株，沉降菌105株）为46种菌种，分别来自20个菌属。排在前3位的是葡萄球菌属共48株，库克菌属共16株，鞘氨醇单胞菌属共13株，其余的菌属包括埃希氏杆菌属、棒状杆菌属、巴斯德氏菌、伯克氏菌属、肠球菌属、泛菌属、假单胞菌属、颗粒链菌属、克雷伯菌属、链球菌属、明串珠菌属、气单孢菌属、沙雷氏菌属、威克斯菌属、微球菌属、芽孢杆菌属、耶尔森氏菌属。根据革兰氏染色结果分类，革兰氏阳性总共92株，占总数80%；革兰氏阴性总共23株，占总数的20%。详细结果见表 2。

结果表明：（1）浮游菌、人员及表面微生物共10株，以葡萄球菌革兰氏阳性球菌为主占60%，其次为居泉沙雷菌及成团泛菌等革兰氏阴性杆菌占30%。（2）沉降菌共105株，葡萄球菌属、库克菌属、链球菌属等革兰氏阳性球菌占71%；其次为鞘氨醇单胞菌、气单孢菌属、假单胞菌属等革兰氏阴性杆菌占22%；革兰氏阳性杆菌占1%；革兰氏阳性芽孢杆菌占6%。详细见图 1和图 2。其中检出3株葡萄球菌具有耐药性。检出的其中1株耐药菌的耐药特征见图 3。

2.3 洁净区微生物污染分析 2.3.1 A级区污染微生物结果分析

该企业A级区环境菌监控结果，共收集到4株微生物，占污染微生物总数的3.5%。3株为少动鞘氨醇单胞菌，1株为库克菌。在A级区的微生物污染物数量、类型相对较少。说明A级区的微生物隔离系统起到了很好的隔离作用。也有可能是因为操作人员较少的缘故。

2.3.2 B级和C级区污染微生物结果分析

B级和C级区共收集到111株微生物，占污染物总数的96.5%。环境微生物监控分离微生物仍以葡萄球菌属为主，合计48株（占B级和C级区总分离株的43.2%）。其中，沃氏葡萄球菌、腐生葡萄球菌和金黄色葡萄球菌分别占B级和C级区总分离株的8.1%、6.3%和5.4%，且多分布在更衣室和洁净走廊、消毒室，可见微生物污染与人员活动密切相关。

2.3.3 表面污染微生物结果分析

采集到操作人员和设备表面微生物共4株均来自B级和C级区，占全部污染菌总数的3.5%。2株为葡萄球菌，1株为棒状杆菌，1株为气单胞菌。

3 讨论 3.1 微生物污染源分析

从菌型分析结果可知，该无菌制剂生产企业洁净区人员及设备表面微生物及沉降菌样品检出率最高的是革兰阳性菌，而居其首位的是葡萄菌属，此类菌广泛存在自然界中，是人体的皮肤及呼吸道黏膜表面的正常菌群，当机体免疫力低下时可引起各种疾病^[8]。其次为库克菌属，此类菌主要分布在水、土壤等自然环境中以及哺乳动物、人的皮肤、黏膜和口咽部。以往认为克氏库克菌是很少见的条件致病菌，未引起足够的重视。近年来由该菌引发的感染增加较快，特别是血流感染和皮肤软组织感染^[9-10]。另外，最近杨锐等^[11]从医务人员手、皮肤黏膜、物体表面、空气等医疗环境样本中已检出8株克氏库克菌。第3位为鞘氨醇单胞菌，是一种能够合成生物聚合物的重要微生物菌种资源。洁净区检出均为人员带入，进入净化区，树立无菌观念，从根本上降低污染的发生。从各区域微生物分离数量看，A级区的微生物污染数量明显比B级和C级区的微生物污染数量小很多，符合区域隔离和空气净化的规律^[12-13]。

3.2 制药企业微生物污染监测作用 3.2.1 评价无菌车间灭菌程序的有效性

无菌制剂车间环境微生物污染检测可以评价无菌车间灭菌程序的有效性，可以根据微生物种类选择适宜的消毒剂。该制药企业分离的微生物采集到的微生物91%以上为沉降菌。除了加强消毒验证，还要注意高效过滤系统的清洗和更换频率是否满足要求。

3.2.2 建立警戒线和纠偏限

通过对数据的分析建立警戒线和纠偏限，当出现某种微生物或微生物指标超限时就应启动灭菌程序。系统的关键参数比如微生物指标超出正常范围但未达到纠偏限度，需要引起警觉，可能需要采取纠正措施的限度标准为纠偏限度；系统的关键参数比如微生物指标超出可接受标准，需要进行调查并采取纠正措施的限度标准。制订警戒限度和纠偏限度方式：（1）（临界值法）对一个时期内所有数据以柱状图模式给出，原则取最近100个采样数据，以第95区间和第99区间作为警戒限度和纠偏限度；（2）（正态分布法）警戒限度=平均值+2σ；纠偏限度=平均值+3σ^[14]。

3.2.3 对污染菌进行溯源分析

当监测结果超出纠偏限度时，则必须立刻启动偏差管理系统或管理系统，对系统超标的原因进行调查，环境检测建立的数据库可以进行溯源分析，帮助判断是哪一环节出现了问题^[15]。

根据2010年版GMP要求，若无菌产品检查结果出现阳性时，应进行原因调查。随着药品检验技术和理念的不断更新，《中华人民共和国药典》2015年版微生物检查法愈加关注生产过程中的微生物控制，强调通过“实验室调查回顾、利用适宜方法”分析检验结果的准确性。调查回顾涉及到药品生产检验的人、机、料、法、环5个方面。而我们的实验对GMP车间人员，设备和空气系统进行监测，建立了该企业净化区的微生物数据库，当样品中检出阳性时，可以对检出菌与数据库中菌进行鉴别比对，同源性分析，找到可能的污染源，帮助企业采取高效有针对性的纠偏措施^[16]。

3.2.4 对污染菌进行耐药分析

在检出的细菌中有3株耐药菌，均为葡萄球菌属；1株为腐生葡萄球菌，能产青霉素酶，对吉他霉素、青霉素G、红霉素、和莫匹罗星产生耐药；1株为表皮葡萄球菌，能产青霉素酶，对苯唑西林、青霉素G耐药；1株为沃氏葡萄球菌能产青霉素酶，对妥布霉素、青霉素G和红霉素耐药。

β-内酰胺类抗生素共同具有1个核心β-内酰胺环，其基本作用机制是与细菌的青霉素结合蛋白结合，从而抑制细菌细胞壁的合成；β-内酰胺酶借助其分子中的丝氨酸活性位点，与β-内酰胺环结合并打开β-内酰胺环，导致青霉素类药物失活，产生耐药性^[17]。据文献报道，环境中人葡萄球菌和表皮葡萄球菌对头孢类、氨基苷类、大环内酯类和氟喹诺酮类药物敏感；人葡萄球菌和溶血葡萄球菌对四环素类药物敏感；葡萄球菌对磺胺类药物有不同程度的耐药^[18-20]。

喹诺酮类药物主要作用于细菌的DNA回旋酶和Ⅳ类拓扑异构酶阻碍DNA复制，当该2种酶的结构变异即可导致耐药，对喹诺酮类耐药主要表现在gyrA基因的变异而影响此类药物与靶位的结合，从而影响细菌对药物的敏感性，产生耐药^[21-22]。

试验中的菌株均采集自生产抗生素药品的GMP净化车间，说明环境中的细菌长期与低剂量的药物残留共存，可能是导致菌株产生耐药性的原因之一，要加强车间清洗验证和监控。