2019, Vol. 39 
风寒感冒颗粒由麻黄、葛根、紫苏叶、防风、桂枝、白芷、陈皮、苦杏仁、桔梗、甘草、干姜组成，辅料为蔗糖、糊精；具有解表发汗，疏风散寒之功效；主要用于风寒感冒，发热，头痛，恶寒，无汗，咳嗽，鼻塞，流清涕等症状；是一种治疗感冒常用的中成药。其质量标准收载于卫生部药品标准[1]，原标准项下只有颗粒剂通则检查项，缺乏对有效成分的控制。根据《中华人民共和国药典》2015年版一部各品种收载的有效成分指标，本文确定通过对盐酸麻黄碱、苦杏仁苷、葛根素、升麻素苷、甘草苷、橙皮苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、桂皮醛、桔梗皂苷D、欧前胡素、甘草酸铵11个成分的含量测定来进行质量控制。
目前，已报道的风寒感冒颗粒中成分的测定方法主要为高效液相色谱法[2-4]，但没有上述11个成分同时测定的方法。Orbitrap高分辨质谱法是比较新的高分辨质谱技术，同时具备液相色谱的高度分离性能及轨道阱高分辨质谱的高敏感性和检测能力，且样品消耗量小，选择性强[5]，分辨率可达100万以上，质量精度可达10-7~10-6 [6]，可进行高精度的定量和定性分析。近年来，Orbitrap高分辨质谱技术的应用日益增多，已广泛用于药品安全[7]、中药成分分析[8-10]、药物动力学[11]、有关物质检查[12]等领域。
本文将超高效液相色谱-四极杆静电场轨道阱高分辨质谱联用技术用于中成药成分的定量分析。通过Full MS/dd-MS2模式，采用正负离子同时采集方式，在1个分析周期内完成对供试品溶液中盐酸麻黄碱、苦杏仁苷、葛根素、升麻素苷、甘草苷、橙皮苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、桂皮醛、桔梗皂苷D、欧前胡素、甘草酸铵共11个成分的高精度一级、二级扫描，得到准确质量数和准确碎片离子信息[13]，具有快速、准确、高灵敏度、高选择性的特点，为中成药的质量控制提供了新手段、新技术。
1 仪器与试药Q Exactive Foucs超高效液相色谱-质谱联用仪（Thermo Fisher Scientific，Germany），配备有HESI源、高压二元泵、自动进样器、柱温箱、在线脱气机（Thermo Fisher Scientific，Germany）；X Calibur 2.2软件（Thermo Fisher Scientific，MA，USA）用以仪器控制和数据处理。KQ-300 GDV温控超声仪（昆山超声仪器有限公司，中国）。
对照品盐酸麻黄碱（含量以C10H15NO•HCl计，为99.6%）购自INTERNATIONAL LABORATORY USA，葛根素（含量以95.4%计）、升麻素苷（含量以96.2%计）、5-O-甲基维斯阿米醇苷（含量以97.4%计）、欧前胡素（含量以99.6%计）、橙皮苷（含量以96.2%计）、苦杏仁苷（含量以90.7%计）、桂皮醛（含量以99.6%计）、桔梗皂苷D（含量以97.9%计）、甘草苷（含量以93.1%计），均购自中国食品药品检定研究院，甘草酸铵（含量以92.7%计）购自北京曼哈格生物科技有限公司。
7批不同厂家生产的风寒感冒颗粒样品为市售。
2 方法与结果 2.1 溶液配制 2.1.1 系列浓度混合对照品溶液精密称取盐酸麻黄碱、苦杏仁苷、葛根素、升麻素苷、甘草苷、橙皮苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、桂皮醛、桔梗皂苷D、欧前胡素、甘草酸铵的对照品各约10 mg，分别置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成单一成分的对照品储备液（约1.0 mg·mL-1）。分别精密吸取上述各储备液适量，加甲醇制成2.0 μg·mL-1的混合对照品中间液，再用10%甲醇水溶液逐步稀释得到200.0、100.0、50.0、20.0、10.0、5.0、1.0、0.5 ng·mL-1的系列浓度混合对照品溶液。
2.1.2 供试品溶液取装量差异项下的样品适量，研细，精密称取细粉约0.5 g，置100 mL量瓶中，加甲醇80 mL，超声（40 kHz，200 W）处理30 min，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，0.22 μm微孔滤膜滤过，精密量取滤液2 mL，置100 mL量瓶中，用10%甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀，即得。
2.2 液相色谱-质谱联用条件 2.2.1 色谱条件色谱柱：Hypersil GOLD aQ C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，2.7 μm），Thermo Fisher Scientific，USA；流动相：甲醇（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0~2 min，85%B；2~15 min，85%B→10%B；15~20 min，10%B）；流速：300 μL·min-1；柱温：30 ℃；进样量：20 μL。
2.2.2 质谱条件Exactive质谱系统配有HESI源，采用正负离子同时扫描模式，喷雾电压3.0 kV，毛细管和雾化器温度分别为320 ℃和250 ℃。鞘气和辅助气分别设为275.8 kPa和103.4 kPa，S-lens RF电压50 V，喷雾气和碰撞气均为氮气。使用校正液含咖啡因、四肽MRFA和U-aramark 1621的混合溶液[14]，3 d校正1次质量轴。扫描方式采用Full MS/dd-MS2模式，此模式包含1次一级准确分子量全扫描（分辨率70 000 FWHM）和1次数据依赖的二级子离子扫描（分辨率17 500 FWHM）。一级全扫描范围为m/z 50~1 300，自动增益控制（AGC）和离子注入时间（IT）分别为1.0 e6和100 ms，数据依赖的二级扫描（dd-MS2）AGC设为2.0 e5，最大IT设为50 ms，isolation window设为1.0 m/z，underfill ratio设为1.0%，intensity threshold设为4.0 e4，exclude isotopes设为“on”，dynamic exclusion设为10.0。11个化合物的保留时间、准确质量数、归一化碰撞能量和二级碎片离子信息见表 1，混合对照品溶液和供试品溶液准确质量数提取图谱见图 1。
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表 1 11个成分的保留时间和准确质量数 Tab.1 Retention time and accurate mass of 11 components |
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图 1 混合对照品溶液（A1和A2）和供试品溶液（B1和B2）准确质量数提取谱图 Fig.1 Extracted ion chromatograms of mixed reference solution(A1 and A2)and sample solution(B1 and B2) |
精密吸取200.0、100.0、50.0、20.0、10.0、5.0、1.0、0.5 ng·mL-1的系列浓度混合对照品溶液，分别进样20 μL，记录峰面积，以待测成分质量浓度X为横坐标，峰面积Y为纵坐标绘制标准曲线并进行线性回归。11个成分的线性范围、回归方程、相关系数分别见表 2。
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表 2 11个成分的回归方程、相关系数、线性范围、定量下限、检测下限和精密度 Tab.2 Regression equations, correlation coefficients, linear ranges, LOQs, LODs and precisions of 11 components |
将混合对照品溶液稀释至不同浓度，进样测定，以信噪比为3:1和10:1时分别计算检测下限和定量下限。结果见表 2。
2.3.3 精密度试验取质量浓度为50.0 ng·mL-1的混合对照品溶液连续进样5次，结果麻黄碱、苦杏仁苷、葛根素、升麻素苷、甘草苷、橙皮苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、桂皮醛、桔梗皂苷D、欧前胡素、甘草酸11个成分峰面积的RSD分别为1.6%、1.8%、1.1%、1.2%、1.9%、1.8%、1.2%、1.9%、1.1%、1.4%、1.0%，均小于2.0%，表明仪器精密度良好。
2.3.4 重复性试验分别精密称取同一风寒感冒颗粒样品6份，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，进样测定，计算盐酸麻黄碱、苦杏仁苷、葛根素、升麻素苷、甘草苷、橙皮苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、桂皮醛、桔梗皂苷D、欧前胡素、甘草酸铵的平均含量分别为2.40、1.69、12.4、14.7、1.75、1.13、3.60、1.29、0.32、0.34、2.40 μg·g-1，RSD分别为2.1%、1.8%、1.2%、1.6%、1.4%、1.1%、1.6%、2.0%、1.4%、1.6%、2.1%，表明方法重复性良好。
2.3.5 稳定性试验取“2.3.4”项下同一供试品溶液，分别于0、2、4、8、16、24、48 h进样测定峰面积，结果麻黄碱、苦杏仁苷、葛根素、升麻素苷、甘草苷、橙皮苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、桂皮醛、桔梗皂苷D、欧前胡素、甘草酸11个成分峰面积的RSD分别为0.85%、1.2%、0.96%、0.85%、0.81%、0.91%、1.1%、1.2%、0.81%、0.93%、0.98%，均小于3.0%，表明供试品溶液在48 h内稳定性良好。
2.3.6 回收率试验精密称取已测知11个成分含量的样品0.25 g共6份，分别置于10 mL量瓶中，精密加入以甲醇制备的含盐酸麻黄碱50 μg·mL-1，苦杏仁苷400 μg·mL-1，葛根素400 μg·mL-1，升麻素苷50 μg·mL-1，甘草苷50 μg·mL-1，橙皮苷100 μg·mL-1，5-O-甲基维斯阿米醇苷50 μg·mL-1，桂皮醛50 μg·mL-1，桔梗皂苷D10 μg·mL-1，欧前胡素10 μg·mL-1，甘草酸铵50 μg·mL-1的混合对照品溶液1.00 mL，按“2.1.2”项下方法制备供试溶液，进样测定，结果见表 3。
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表 3 回收率试验结果 Tab.3 The results of recovery test |
取7批风寒感冒颗粒样品，分别按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项下条件进样测定，以标准曲线法计算含量，结果见表 4。
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表 4 11种成分的含量测定结果 Tab.4 Content determination results of 11 components |
风寒感冒颗粒处方中含11味药材，其中所含成分种类较多，采用HPLC-UV法测定时进行检测的色谱峰干扰较多，方法灵敏度低，不能同时满足定性定量的需求。UPLC-Q-Orbitrap高分辨质谱法准确、快速，具有在高灵敏度的前提下保证高分辨率（高精度）的优点[15]，可以在一针18 min内同时完成11个成分的定量测定和定性分析。
3.2 提取溶剂的选择试验考察了甲醇-水（2:8）、甲醇-水（1:1）、乙腈-水（1:1）、乙腈、甲醇的提取效果。结果表明上述5种溶剂提取效率差别明显，甲醇提取效果最好，但在测定时发现，甲醇对峰形有一定影响，加入适当比例水后，峰形和响应值明显改善，因此最终确定用甲醇提取，用甲醇-水（1:9）即10%甲醇水溶液稀释定容。
3.3 质谱扫描模式的选择本实验采用了Full MS/dd-MS2模式，以正负离子同时采集方式，在1个分析周期内完成对样品中11个成分的高精度一级、二级扫描，得到准确质量数和准确碎片离子信息，在完成定量分析的基础上还能同时得到化合物二级准确子离子信息，可以作为定性分析的依据。
3.4 测定结果分析7批样品中，有2批未检出桂皮醛和升麻素苷，其他5批样品中11个成分均有检出，但含量差别显著，其中盐酸麻黄碱的含量有的相差10倍以上，表明有的厂家制剂投料或某些环节可能存在问题，提示该品种国家药品标准尚有提升空间。
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