2019, Vol. 39 
2. 武汉科技大学化学与化工学院, 武汉 430081;
3. 湖北科技学院糖尿病心脑血管病变湖北省重点实验室, 咸宁 437000;
4. 湖北科技学院核技术与化学生物学院, 咸宁 437000
2. College of Chemistry and Chemical Engineering, Wuhan University of Science and Technology, Wuhan, 430081, China;
3. Hubei Key Laboratory of Diabetes and Angiopathy, Hubei University of Science and Technology, Xianning 437000, China;
4. College of Nuclear Technology and Chemical Biology, Hubei University of Science and Technology, Xianning 437000, China
酚类化合物是植物中的一类重要次生代谢产物，是天然的植物化学物质，主要来自苯丙氨酸，较少来自酪氨酸，广泛存在于食品和营养品中[1-3]。酚类化合物结构多样，但可以定义为具有1个或多个羟基的芳环族化合物。根据芳香烃环所直接连接的羟基数目和功能部分的类型，主要的多酚类有黄酮类、酚酸类、酚醇类、二苯乙烯类和木脂素类[4]。多酚是人类饮食的重要组成部分，广泛存在于浆果、葡萄/葡萄酒、茶、巧克力/可可、咖啡、大豆和其他水果和蔬菜中[5]。起初，酚类化合物因其强大的抗氧化活性而备受关注，后来，在天然食物中发现的酚类对氧化损伤导致的疾病具有潜在的保护作用（例如冠心病，中风和癌症）。最近，越来越多的科学文献表明酚类化合物对癌症具有有效的抑制入侵和转移作用[6]。由于多酚的生理活性与他们的结构相关[7]，研究植物提取物中的多酚含量，以评估它们对药理活性的影响[8]。
桂花（Osmanthus fragrans Lour.）为木犀科（Oleaceae）木犀属（Osmanthus）植物，产于中国西南部等地，是我国十大传统名花之一。《本草纲目》中记载：桂花生津，辟臭，治疗风虫牙疼。亦有研究报道，桂花具有疏肝理气、祛痰止咳和顺肺开胃的功效[9]。文献研究表明，桂花含酚类、环烯醚萜类、三萜、木脂素类、苯丙素类、苯乙醇类和生物碱类[10-15]等多种化学成分，因此它具有良好的药用价值。薛阿辉等[16]采用HPLC法从四季桂花醇提液中检测到15个多酚类化合物，利用电喷雾萃取电离质谱分析检测到8个多酚化合物。研究桂花中的酚类化合物，开发新的天然抗氧化剂，对人类健康有极大的益处。
以往的研究多局限在桂花提取分离工艺、性质研究及药理活性方面[17-19]，并未系统比较桂花中单个多酚类活性成分含量的差异以及在不同品种桂花中的分布情况。目前，对桂花成分的含量测定主要采用紫外分光光度法和高效液相色谱法[20-22]，还未见用液质联用技术分析桂花中多酚类活性成分的国内外文献报道。高效液相色谱串联质谱法（HPLC-MS/MS法）通常用于酚类化合物结构特征鉴定[23]。与HPLC-DAD方法相比，HPLC-MS/MS方法具有更高灵敏度、选择性和更高通量定量的优点[24]。
本研究采用HPLC-MS/MS技术对3个不同桂花品种（丹桂、金桂、银桂）中绿原酸、咖啡酸、毛蕊花糖苷、柚皮苷、芦丁、阿魏酸和槲皮素7个多酚类活性成分进行鉴定，结合对照品质谱对比，确定了桂花中多酚类活性成分的化合组成及含量，为进一步研究桂花的开发和利用提供科学依据。
1 材料、试剂与仪器 1.1 仪器岛津LCMS-8040液相色谱-三重四极杆质谱联用仪，配有ESI离子源、LC-20ADXR型二元梯度泵、SIL-20ACXR型自动进样器、CTO-20AC型柱温箱和CBM-20A型系统控制器；FA2004型电子天平（上海舜宇恒平仪器有限公司）；PL-S100型超声波清洗机（康士洁有限公司）；PCE-3000型干燥箱（上海索谱有限公司）。
1.2 材料桂花样品采摘于湖北咸宁市桂花镇，采收日期为2017年9月。3个桂花品种为丹桂品种：小叶丹桂（Osmanthus fragrans ‘Xiaoye Dangui’）；银桂品种：波叶银桂（Osmanthus fragran ‘Boye Yingui’）；金桂品种：柳叶金桂（Osmanthus fragrans ‘Liuye Jingui’）。每个桂花品种的样品采集于3个不同地方的桂花树，参考[20]中的干燥方法，75 ℃热风干燥至恒重，粉碎过0.25 mm筛，备用。
1.3 试药甲醇为色谱纯试剂（Sigma公司），甲酸（韩国德山药业工业），乙醇（国药集团化学试剂有限公司），纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司），对照品绿原酸、咖啡酸、毛蕊花糖苷、柚皮苷、芦丁、阿魏酸、槲皮素均购自上海源叶生物科技有限公司，纯度≥98%。
2 方法与结果 2.1 溶液制备 2.1.1 供试品溶液称取样品粉末2.5 g，精密称定，加入80%乙醇水溶液50 mL，称量，超声提取（600 W，40 kHz，80 ℃）30 min，放冷，称量，用80%乙醇水溶液补足减失的量，摇匀，过滤。吸取滤液1 mL，以80%乙醇稀释5倍，使用0.22 μm的微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。
2.1.2 对照品储备液精密称取各对照品0.005 g，分别用甲醇制成质量浓度为1 mg·mL-1的单一成分的溶液，即得。
2.2 HPLC-MS/MS分析条件 2.2.1 色谱条件采用Shim-pack VP-ODS色谱柱（2.0 mm×150 mm，5 μm），柱温为30 ℃，以甲醇（A）-0.1%甲酸水（B）流动相，梯度洗脱（0~5 min，90%B→10%B；5~10 min，10%B；10~11 min，10%B→90%B），流速0.2 mL ·min-1，进样量为5 μL。
2.2.2 质谱条件采用电喷雾（electrospray ionization，ESI）负离子模式，扫描方式为多反应检测（multiple reaction monitoring，MRM），电喷雾电压3.5 kV，雾化气体N2，雾化气流速3 L·min-1，离子源温度250 ℃，碰撞气体为高纯氮气，碰撞气压力230 kPa。质谱参数见表 1。
|
表 1 7个多酚类成分的质谱参数 Tab.1 Mass spectrometry parameters of seven polyphenolics |
在上述条件下，各多酚类成分的MRM色谱图见图 1~4，二级质谱图见图 5~11。
|
1.绿原酸（chlorogenic acid）2.咖啡酸（caffeic acid）3.毛蕊花糖苷（verbascoside）4.柚皮苷（naringin）5.芦丁（rutin）6.阿魏酸（ferulic acid）7.槲皮素（quercetin） 图 1 混合对照品的MRM色谱图 Fig.1 MRM chromatograms of the mixed standard |
|
1.绿原酸（chlorogenic acid）2.咖啡酸（caffeic acid）3.毛蕊花糖苷（verbascoside）4.柚皮苷（naringin）5.芦丁（rutin）6.阿魏酸（ferulic acid）7.槲皮素（quercetin） 图 2 丹桂的MRM色谱图 Fig.2 MRM chromatograms of Dangui |
|
1.绿原酸（chlorogenic acid）2.咖啡酸（caffeic acid）3.毛蕊花糖苷（verbascoside）4.柚皮苷（naringin）5.芦丁（rutin）6.阿魏酸（ferulic acid）7.槲皮素（quercetin） 图 3 金桂的MRM色谱图 Fig.3 MRM chromatograms of Jingui |
|
1.绿原酸（chlorogenic acid）2.咖啡酸（caffeic acid）3.毛蕊花糖苷（verbascoside）4.柚皮苷（naringin）5.芦丁（rutin）6.阿魏酸（ferulic acid）7.槲皮素（quercetin） 图 4 银桂的MRM色谱图 Fig.4 MRM chromatograms of Yingui |
|
Fig.5 Secondary mass spectrum of chlorogenic acid |
|
图 6 咖啡酸的二级质谱图 Fig.6 Secondary mass spectrum of caffeic acid |
|
图 7 毛蕊花糖苷的二级质谱图 Fig.7 Secondary mass spectrum of verbascoside |
|
图 8 柚皮苷的二级质谱图 Fig.8 Secondary mass spectrum of naringin |
|
图 9 芦丁的二级质谱图 Fig.9 Secondary spectrum of rutin |
|
图 10 阿魏酸的二级质谱图 Fig.10 Secondary mass spectrum of ferulic acid |
|
图 11 槲皮素的二级质谱图 Fig.11 Secondary mass spectrum of quercetin |
取“2.1.2”项下的对照品储备液适量，混合，再用甲醇稀释配制8个系列梯度浓度的混合对照品溶液（50、100、200、500、800、1 000、2 000、4 000 ng·mL-1）。按“2.2”项条件进行测定。以峰面积Y为纵坐标，质量浓度X为横坐标，进行回归，结果见表 2，可知各成分在各自范围内线性关系良好。
|
|
表 2 各成分线性关系 Tab.2 Linear relationship of components |
精密吸取混合对照品溶液，连续进样6次，计算峰面积的RSD。结果见表 3。
|
|
表 3 精密度、稳定性、重复性、加样回收率 Tab.3 Precision, stability, repeatability and recovery |
取混合对照品溶液，室温放置，在0、2、4、6、8、10、12、24 h进样分析，测定峰面积并计算RSD。结果见表 3。
2.3.4 重复性考察取丹桂样品6份，平行制备供试品溶液，进样测定样品中7个成分含量并计算RSD。结果见表 3。
2.3.5 加样回收率考察精密称取已测知7种物质含量的丹桂样品粉末1.25 g共6份，分别加入1 mg·mL-1混合对照品溶液1 mL，按“2.1.1”项方法制备供试溶液，进样分析，分别计算7个成分的平均回收率和RSD。结果见表 3。
2.4 样品含量测定取3个桂花品种的3个不同地方的样品，分别按“2.1.1”项方法制备供试品溶液各5份，在“2.2”项色谱条件下进样测定，按照回归方程计算每组样品的7个多酚类成分的含量，结果见表 4。
|
|
表 4 不同品种桂花中7个多酚类成分的含量（mg·g-1，X±S，n=5） Tab.4 Contents of seven polyphenolic ingredientsin different varieties of O.fragrans |
本实验考察不同提取方法（索式提取法、微波提取法和超声提取法）对桂花多酚提取的影响。结果表明，超声提取法是一种最高效的提取方法，微波提取法提取率次之，索式提取法提取率最低，并且提取时间较长。所以本实验以超声提取法提取桂花多酚。同时，本实验也比较用体积分数分别为60%、70%、80%、90%、100%的乙醇超声提取桂花多酚，随着乙醇体积分数的增大，多酚含量也增大，用80%乙醇提取的含量最高，随着乙醇体积分数继续增大，多酚含量显著下降。根据相似相容的原理，表明80%的乙醇和多酚极性最为相近，当乙醇体积分数继续增加时，两者的极性差异也增大，使多酚的溶出减小[26]。所以，80%乙醇可以作为提取多酚合适的溶剂。
3.2 色谱质谱条件的选择分析桂花中的多酚类活性成分时，分别考察了甲醇-水、甲醇-水（0.05%甲酸）、甲醇-水（0.1%甲酸）、甲醇-水（0.2%甲酸）、甲醇-水（0.2%甲酸和5 mmol·L-1醋酸铵）、甲醇-水（5 mmol·L-1醋酸铵）、乙腈-水（0.05%甲酸）、乙腈-水（0.1%甲酸）、乙腈-水（0.2%甲酸）等流动相系统，结果发现甲醇的灵敏度比乙腈高，加酸大的体系色谱峰拖尾较严重，当用0.1%甲酸避免拖尾，色谱峰形最好，且灵敏度最高，故选择甲醇-水（0.1%甲酸）为流动相。
桂花多酚类活性成分中大多属于有机酸类和黄酮苷类，实验中发现采用负离子检测，成分响应优于正离子检测，且干扰更小。本实验在流动相中加入了少量甲酸，此时多酚类可形成稳定的[M-H]-离子。对每个测定化合物进行MRM条件的优化，优选最佳的母离子和检测子离子，并且优选出每1个检测定量离子对最佳的的碰撞电压。
3.3 不同品种桂花中多酚类活性成分含量分析本实验采用HPLC-MS/MS方法研究3个桂花品种中7个多酚类活性成分的含量测定。薛阿辉等[16]采用HPLC法检测四季桂花中多酚类化合物，涉及40 min的分析时间，本实验HPLC的总分析时间为11 min，在短时间内完成对7个主要多酚类成分的同时测定，大大缩短了检测分析的时间。此外，HPLC-MS/MS方法与HPLC结合紫外分光光度计检测方法相比，灵敏度和选择性更高，本实验检测到桂花提取液中7个成分的含量达ng·mL-1级别。
不同品种桂花中所含的化学成分有一定的相似性：3个品种桂花中均含有绿原酸、咖啡酸、阿魏酸、槲皮素、芦丁、柚皮苷、毛蕊花糖苷；3个桂花品种中都以绿原酸、槲皮素和毛蕊花糖苷为主，以阿魏酸、柚皮苷、芦丁和咖啡酸为辅。同一品种中，毛蕊花糖苷含量最高；丹桂和金桂中柚皮苷最低，银桂中咖啡酸含量最低。
4 结论综上，本文用建立的HPLC-MS/MS法同时测定3个不同品种桂花中绿原酸、咖啡酸、毛蕊花糖苷、柚皮苷、芦丁、阿魏酸、槲皮素7个多酚类活性成分，并对不同品种桂花中多酚类活性成分的含量进行了分析，该方法简便、快速、灵敏，专属性强，可用于其他药用植物中活性成分的提前分析比较提供参考，同时为桂花资源的开发利用具有重要的科学意义。
| [1] |
van SUMERE CF. 2-phenols and phenolic acids[J]. Methods Plant Biochem, 1989, 1: 29. DOI:10.1016/B978-0-12-461011-8.50008-1 |
| [2] |
SHAHIDI F. Antioxidants in food and food antioxidants[J]. Die Nahrung, 2000, 44(3): 158. DOI:10.1002/1521-3803(20000501)44:3<158::AID-FOOD158>3.0.CO;2-L |
| [3] |
SHAHIDI F. Antioxidants in plants and Oleaginous seeds[J]. Acs Natl Meet Book Abstracts, 2002, 807: 162. |
| [4] |
D'ARCHIVIO M, FILESI C, DI BR, et al. Polyphenols, dietary sources and bioavailability[J]. Ann Ist Super Sanita, 2007, 43(4): 348. |
| [5] |
MANACH C, SCALBERT A, MORAND C, et al. Polyphenols:food sources and bioavailability[J]. Am J Clin Nutr, 2004, 79(5): 727. DOI:10.1093/ajcn/79.5.727 |
| [6] |
SLIVA D. Suppression of cancer invasiveness by dietary compounds[J]. Mini Rev Med Chem, 2008, 8(7): 677. DOI:10.2174/138955708784567412 |
| [7] |
KHLEBNIKOV AI, SCHEPETKIN IA, DOMINA NG, et al. Improved quantitative structure-activity relationship models to predict antioxidant activity of favonoids in chemical, enzymatic, and cellular systems[J]. Bioorg Med Chem, 2007, 15(4): 1749. DOI:10.1016/j.bmc.2006.11.037 |
| [8] |
ARFAN M, KHAN R, RYBARCZYK A, et al. Antioxidant activity of mulberry fruit extracts[J]. Int J Mol Sci, 2012, 13(2): 2472. DOI:10.3390/ijms13022472 |
| [9] |
刘龙昌, 向其柏. 木犀属植物的研究进展[J]. 南京林业大学学报(自然科学版), 2003, 27(2): 84. LIU LC, XIANG QB. Research Progress of Osmanthus Plants[J]. J Nanjing Forest Univ(Nat Sci Ed), 2003, 27(2): 84. DOI:10.3969/j.issn.1000-2006.2003.02.020 |
| [10] |
HUNG CY, TSAI YC, LI KY. Phenolic antioxidants isolated from the flowers of Osmanthus fragrans[J]. Molecules, 2012, 17(9): 10724. DOI:10.3390/molecules170910724 |
| [11] |
尹伟, 宋祖荣, 刘金旗, 等. 桂花的化学成分研究[J]. 中国中药杂志, 2015, 40(4): 679. YIN W, SONG ZR, LIU JQ, et al. Study on the chemical constituents of sweet-scented Osmanthus[J]. China J Chin Mater Med, 2015, 40(4): 679. |
| [12] |
KUBBA A, TILLEQUIN F, KOCH M, et al. Iridoids, lignan, and triterpenes from Osmanthus cymosus[J]. Biochem Syst Ecol, 2005, 33(3): 305. DOI:10.1016/j.bse.2004.06.008 |
| [13] |
LEE DG, LEE SM, BANG MH, et al. Lignans from the flowers of Osmanthus fragrans var.aurantiacus and their inhibition effect on NO production[J]. Arch Pharm Res, 2011, 34(12): 2029. DOI:10.1007/s12272-011-1204-y |
| [14] |
JIANG Y, MAO S, HUANG W, et al. Phenylethanoid glycoside profiles and antioxidant activities of Osmanthus fragrans Lour.flowers by UPLC/PDA/MS and simulated digestion model[J]. J Agric Food Chem, 2016, 64(12): 2459. DOI:10.1021/acs.jafc.5b03474 |
| [15] |
XIONG L, MAO S, LU B, et al. Osmanthus fragrans flower extract and acteoside protect against d-galactose-induced aging in an ICR mouse model[J]. J Med Food, 2016, 19(1): 54. DOI:10.1089/jmf.2015.3462 |
| [16] |
薛阿辉, 崔萌, 邹华杰, 等. 桂花多酚类化合物电喷雾萃取电离质谱分析[J]. 食品科学, 2018, 39(16): 221. XUE AH, CUI M, ZOU HJ, et al. Electrospray ionization mass spectrometry analysis of Osmanthus polyphenols[J]. Food Sci, 2018, 39(16): 221. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201816032 |
| [17] |
LU BY, LI M Q, ZHOU F, et al. The Osmanthus fragrans flower phenylethanoid glycoside rich extract:acute and subchronic toxicity studies[J]. J Ethnopharmacol, 2016, 187: 205. DOI:10.1016/j.jep.2016.04.049 |
| [18] |
JIANG Y, MAO S, HUANG W, et al. Phenylethanoid glycoside profiles and antioxidant activities of Osmanthus fragrans Lour.flowers by UPLC/PDA/MS and simulated digestion model[J]. J Agric Food Chem, 2016, 64(12): 2459. DOI:10.1021/acs.jafc.5b03474 |
| [19] |
李桂华, 王苗苗, 贺魏, 等. 桂花种子环烯醚萜苷的提取工艺与抗血栓活性研究[J]. 中草药, 2018, 49(13): 3033. LI GH, WANG MM, HE W, et al. Study on extraction technology and antithrombotic activity of iridoid glycosides from Osmanthus fragrans[J]. Chin Tradit Herb Drugs, 2018, 49(13): 3033. DOI:10.7501/j.issn.0253-2670.2018.13.012 |
| [20] |
李焕, 缪月英, 杨珊珊, 等. 高效液相色谱法同时测定桂花中红景天苷和毛蕊花苷的含量[J]. 中国药学杂志, 2013, 48(3): 228. LI H, MIAO YY, YANG SS, et al. Simultaneous determination of salidroside and verbascoside in Osmanthus fragrans by high performance liquid chromatography[J]. Chin Pharm J, 2013, 48(3): 228. |
| [21] |
陈培珍, 林志銮, 苏丽鳗. 超声波辅助提取桂花总黄酮及其抗氧化活性[J]. 湖北农业科学, 2013, 52(20): 5023. CHEN PZ, LIN ZL, SU LM. Ultrasonic-assisted extraction of total flavonoids from Osmanthus fragrans L.and its antioxidant activity[J]. Hubei Agric Sci, 2013, 52(20): 5023. |
| [22] |
田成. 桂花果实多酚的超声波提取及抗氧化活性研究[J]. 食品科学, 2011, 32(24): 106. TIAN C. Study on ultrasonic extraction and antioxidant activity of polyphenols from Osmanthus fragrans fruit[J]. Food Sci, 2011, 32(24): 106. |
| [23] |
MARCZAK Ł, STOBIECKI M, JASIŃSKI M, et al. Fragmentation pathways of acylated flavonoid diglucuronides from leaves of Medicago truncatula[J]. Phytochem Anal, 2010, 21(3): 224. DOI:10.1002/pca.1189 |
| [24] |
GEORGIŢA C, SORA I, ALBU F, et al. Comparison of a LC/MS method with a LC/UV method for determination of metformin in plasma samples[J]. Farmacia, 2010, 58(2): 158. |
| [25] |
义雯, 蒋红芝. 牛蒡热风干燥工艺研究[J]. 食品研究与开发, 2017, 38(13): 132. YI W, JIANG HZ. Study on hot air drying process of burdock[J]. Food Res Dev, 2017, 38(13): 132. DOI:10.3969/j.issn.1005-6521.2017.13.027 |
| [26] |
YANG L, JIANG JG, LI WF, et al. Optimum extraction process of polyphenols from the bark of Phyllanthus emblica L.based on the response surface methodology[J]. J SepSci, 2015, 32(9): 1437. |