2019, Vol. 39 
2. 西南大学农学与生物科技学院, 重庆 400715;
3. 贵州大学烟草学院, 贵阳 550025;
4. 重庆恒林农业开发有限公司, 重庆 400700
2. College of Agronomy and Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400715, China;
3. College of Tobacco Science, Guizhou University, Guiyang 550025, China;
4. Chongqing Henglin Agricultural Development Co. Ltd., Chongqing 400700, China
国槐（Sophora japonica Linn.）属豆科蝶形花亚科多年生落叶乔木，是集药、食、材、赏于一体的优良树种，其未开放的花蕾为槐米，收录于2015年版《中华人民共和国药典》（简称《中国药典》）和国家卫健委最新发布的药食同源目录中，是医药和食品领域的重要原材料[1-2]。
国槐在全国大部分地区均有栽培，在当前槐米生产中，初加工仍以传统的蒸汽杀青后晒干的方式为主，小规模的专业合作社或散户种植户使用此方式生产的成本低，易操作，有学者建议采用此方式进行产地槐米初加工[3]，但是此方式在采收期如遇到阴雨天气时不利于及时干燥，且生产效率低下；大规模的规范化槐米种植基地不宜采用此种初加工方式，因其不利于大量鲜槐米的初加工，故需选用适合大规模生产的杀青和干燥一体化机械设备进行初加工，但目前尚未见应用。有科研人员对槐米初加工的问题进行研究，考察不同的烘干温度条件对槐米中芦丁含量的影响，表明90 ℃烘干较优[4]；还有学者对槐米自然晒干、蒸后晒干、65~70 ℃烘干、蒸后65~70 ℃烘干、炒干、蒸后炒干和热水烫后晒干等干燥方式进行研究，结果表明，以蒸后晒干为最佳[3]。这些研究结果只是针对以芦丁1种组分来评价槐米品质并确定初加工方式的，故均无法应用于生产。基于1种或少数几种有效成分的量来进行药材品质评价，通常难以真正反映其品质与疗效的关系，因临床疗效不一定就是某1种或少数几种成分的作用。研究发现，槐米主要组分黄酮类物质（槲皮素及其糖苷衍生物）是槐米的质量标志物，其中芦丁含量最高，槲皮素次之。芦丁是槲皮素的C-3位上连接了鼠李糖和葡萄糖苷而成，染料木素、山奈酚和异鼠李素均为槲皮素异构化的衍生物。芦丁在不同环境条件下可能进行相互转化，如：高温处理前后，芦丁含量显著降低，槲皮素、染料木素、山奈酚和异鼠李素的含量显著增加；还有不同槐米样品中的各黄酮类组分含量通常是此高彼低的，不同的组分有不同的功效，因此，不能仅从槐米药效组分含量高低来评价其品质，尤其是新仪器、新方法快速发展的现阶段，应将品质评价指标更加深入、细化和丰富[5]。抗氧化是黄酮类物质的重要作用之一，故以总黄酮、芦丁、槲皮素、染料木素、山奈酚和异鼠李素等质量标志物的含量再加上抗氧化能力，评价其品质更加合理或在前人研究的基础上更加进步[5-10]。
初加工环节是影响中药材、果蔬等农产品质量的主要影响因素之一，而槐米采用何种产地初加工方式既方便于操作，又成本低廉，还能保证其品质，目前尚未见有相关的系统研究报道。本文拟从槐米初加工方式对总黄酮、芦丁、槲皮素、染料木素、山奈酚、异鼠李素等质量标志物含量以及1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）、羟自由基清除率、超氧阴离子自由基清除率、脂质过氧化抑制率等的影响进行研究，确定最佳槐米产地初加工方法，为生产提供理论支撑和技术指导。
1 材料与方法 1.1 试验材料槐米均采自重庆市北碚区东阳街道西山坪金槐基地7年树龄盛花期国槐。
1.2 试剂与仪器对照品芦丁（批号100080-201409）、槲皮素（批号100081-201408）、染料木素（批号111704-201302）、山柰酚（批号110861-201310）和异鼠李素（批号110860-201410）均购于中国食品药品检定研究院，质量分数大于98%。乙腈、甲醇和甲酸均为色谱纯，DPPH、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，DADH）、四唑氮蓝（nitro-blue tetrazolium，NBT）、吩嗪硫酸甲酯（phenazine methosulfate，PMS）、乙醚、乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、硫酸亚铁、菲罗啉、过氧化氢、三羟甲基氨基甲烷、盐酸、硫代巴比妥酸、卵磷脂、三氯化铁和抗坏血酸等均为分析纯。
Shimadzu LC-30AD系列超高效液相色谱仪，具二极管阵列检测器检测器、真空脱气机、高压二元泵、自动进样器、柱温箱，岛津公司；GZX-9076MBE电热鼓风干燥箱，上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；UV-2600紫外可见分光光度计，岛津公司；BSA4202S万分之一电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；CEM Mars 6微波消解/萃取系统，CEM公司；DFY-1000D高速粉碎机，温岭市林大机械有限公司。
1.3 试验设计试验采用二因素裂区设计，主区设置蒸汽杀青（在槐米干燥前）和不杀青2种方式，副区设置晒干、105 ℃烘干和微波干燥3种干燥方式（见表 1），每处理3次重复。
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表 1 试验设计 Tab.1 Experimental design |
取样品1 g，精密称定，置索式提取器中，加乙醚适量，加热回流至提取液无色，放冷，弃去乙醚液。再加甲醇90 mL，加热回流至提取液无色，转移至100 mL量瓶中，用甲醇少量洗涤容器，洗液并入同一量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。精密量取10 mL，置100 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀。精密量取3 mL，置25 mL量瓶中，加水至6 mL，加5%亚硝酸钠溶液1 mL，混匀，放置6 min，加10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀，放置6 min，加氢氧化钠溶液10 mL，再加水至刻度，摇匀，放置15 min，在500 nm波长处测定吸收度，根据标准曲线计算总黄酮含量。
1.4.2 芦丁、槲皮素、染料木素、山奈酚和异鼠李素的含量测定[11]样品粉碎后过100目筛，提取溶剂为甲醇，液料比50:1，微波功率300 W，提取时间80 s，放至室温时用0.22 μm针筒过滤器过滤，滤液收集于1.5 mL进样瓶。用HPLC法测定5个组分的含量，Kinetex C18色谱柱（100 mm × 2.1 mm，2.6 μm），柱温40 ℃，洗脱时间为5 min，流动相为0.1%甲酸-乙腈（71:29），在200~400 nm内扫描，流速为0.35 mL·min-1。参照文献[5]计算5个组分的含量。
1.4.3 DPPH、羟自由基和超氧阴离子清除率测定[12-13]取样品溶液（制法同“1.4.2”项下）0.5 mL和0.1 mmol·L-1 DPPH乙醇溶液2 mL，25 ℃时反应30 min，反应结束后在517 nm波长下测定吸收度，DPPH清除率=（1-A样品/A空白）×100%；另取样品溶液（制法同“1.4.2”项下）0.5 mL和16 mmol·L-1 Tris-HCl（含557 μmol·L-1 NADH、108 μmol·L-1 NBT和45 μmol·L-1 PMS）3 mL混合，25 ℃时反应5 min，反应结束后在560 nm波长下测定吸收度，超氧阴离子自由基清除率=（1-A样品/A空白）×100%；取样品溶液（制法同“1.4.2”项下）0.5 mL、5 mmol·L-1菲罗啉溶液1 mL、pH 7.4、50 mmol·L-1的磷酸缓冲液2 mL、7.5 mmol·L-1硫酸亚铁溶液0.5 mL和0.1% H2O2 0.5 mL，混合，摇匀，37 ℃下反应1 h，反应结束后在510 nm波长下测定吸收度，羟自由基清除率=（1-A样品/A空白）×100%。
1.4.4 脂质过氧化抑制能力测定[14]于10 mL离心管中加入卵磷脂溶液、400 μmol·L-1氯化铁溶液、400 μmol·L-1抗坏血酸和样品溶液各1 mL，充分混匀，避光37℃水浴1 h，再加入TCA-TBA-HCl溶液（TCA 15 g、TBA 0.37 g和浓HCl 2 mL，加入水中，调体积至100 mL）2 mL，90~100℃水浴15 min，迅速冷却，2 000 r·min-1离心10 min，取上清液在535 nm波长下测定吸收度；以双蒸水代替样品同法制作空白，脂质过氧化抑制率=（1-A样品/A空白）×100%。
1.5 数据处理利用Excel 2016进行数据整理及作图，用SPSS 22.0进行方差分析。
2 结果与分析 2.1 初加工方式对总黄酮含量的影响本试验设置不同的初加工方式来考察其对槐米总黄酮含量的影响，由表 2可知，鲜槐米在干燥前进行蒸汽杀青和不杀青2种方式对其总黄酮含量没有显著影响；晒干、105 ℃烘干和微波干燥3种干燥方式对总黄酮含量也没有显著影响。因此，初加工方式对槐米总黄酮含量影响不显著。
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表 2 初加工方式对总黄酮含量的影响（mg·g-1） Tab.2 Effects of primary processing on the total flavonoids content |
由表 3可知，槐米干燥前进行蒸汽杀青对其芦丁含量影响显著，干燥前进行蒸汽杀青处理后的芦丁含量显著高于干燥前不进行杀青处理的；3种干燥方式同样对其芦丁含量影响显著，微波干燥和105 ℃烘干处理优于晒干处理，以干燥前进行蒸汽杀青与杀青后105 ℃烘干组合、干燥前进行蒸汽杀青与杀青后微波干燥组合和干燥前不进行杀青与直接微波干燥3种组合的含量最高，与其他处理差异显著。因此，为保证槐米中芦丁的含量，确定干燥前进行蒸汽杀青，杀青后在105 ℃下烘干或微波干燥。
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表 3 初加工方式对芦丁含量的影响（mg·g-1） Tab.3 Effects of primary processing on the rutin content |
由表 4可知，初加工方式对槐米中槲皮素、染料木素、山奈酚和异鼠李素的含量影响显著，槐米干燥前不进行杀青处理的各组分含量均优于干燥前进行蒸汽杀青的处理，且差异显著；槲皮素、山奈酚和异鼠李素在105 ℃烘干优于晒干和微波干燥，以干燥前不进行杀青直接在105 ℃下烘干处理其含量最高；染料木素在晒干处理下优于其他2种干燥处理，其中以干燥前不进行杀青直接晒干处理优于其他处理，且差异显著。因此，从槲皮素、染料木素、山奈酚和异鼠李素含量的角度考虑，应在槐米干燥前不进行杀青处理，直接在105 ℃下烘干为佳。
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表 4 初加工方式对槲皮素等4个组分含量的影响（mg·g-1） Tab.4 Effects of primary processing on the quercetin, genistein, kaempforel and isorhametin content |
由表 5可知，槐米干燥前蒸汽杀青和不进行杀青以及晒干、105 ℃烘干和微波干燥3种方式对DPPH、羟自由基清除率、超氧阴离子自由基清除率和脂质过氧化抑制率等抗氧化能力的影响均不显著；槐米干燥前进行蒸汽杀青处理对超氧阴离子自由基清除率影响不显著，但是，干燥方式对自由基清除率影响显著，105 ℃烘干处理优于微波干燥，微波干燥又优于晒干处理。因此，从DPPH、羟自由基清除率、超氧阴离子自由基清除率和脂质过氧化抑制率等抗氧化能力角度考虑，应在槐米干燥前根据实际初加工能力选择蒸汽杀青或不杀青均可，并在105 ℃下烘干为佳。
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表 5 初加工方式对槐米抗氧化能力的影响（%） Tab.5 Effects of primary processing on the antioxidant capacity |
槐米富含黄酮类物质，其中芦丁含量最高，其次是槲皮素，还含有山奈酚、异鼠李素等组分，但是其总黄酮及组分含量受生长环境或产地初加工条件等的影响，导致不同样品的总黄酮及各组分含量差异显著[1-5]。抗氧化是黄酮类物质的重要作用之一，试验发现槲皮素清除DPPH和羟自由基的能力最强，其次是山奈酚和芦丁，再次是异鼠李素，染料木素的清除率最低；槲皮素、山奈酚和异鼠李素清除超氧阴离子自由基的能力最强，芦丁和染料木素的清除率极低，不同黄酮组分及含量显著影响槐米的抗氧化能力。随着新仪器、新技术等的快速发展，以槐米的总黄酮及组分含量和抗氧化能力综合评价其品质的方法更科学，易操作，成本低、效率高，也易于推广应用。
本研究以槐米的总黄酮、芦丁、槲皮素、染料木素、山奈酚和异鼠李素等质量标志物含量和抗氧化能力对其产地初加工方式进行评价，结果表明；以总黄酮为主要目标，在槐米干燥前进行蒸汽杀青处理或不杀青均可，根据实际条件选择晒干、105℃烘干和微波干燥3种干燥方式中的任意1种均可；以芦丁为主要目标，应在槐米干燥前进行蒸汽杀青处理，杀青后选择105 ℃烘干或微波干燥任意1种干燥方式干燥；以槲皮素、染料木素、山奈酚和异鼠李素组分为主要目标，应在槐米干燥前不进行杀青处理，直接在105 ℃下烘干为佳；以所有组分和抗氧化能力以及槐米当前主要用途为综合考虑因素，应在槐米干燥前进行蒸汽杀青处理，杀青后在105 ℃下烘干，这种初加工方式比传统晒干方式节省了反复晒晾管理的劳动成本，节省了建设晒场的成本，增加了能源消耗，但提高了初加工效率，提升了槐米品质，克服了阴雨天气带来的经济损失，且烘烤设备价格适中，利于推广应用。
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