克霉唑为广谱抗真菌药，对多种真菌尤其是白色念珠菌具有较好的抗菌作用^[1-2]，对浅表真菌及某些深部真菌均有抗菌作用^[3]。咪唑是克霉唑主要的合成原料，作为克霉唑的有关物质，咪唑及二苯基一（2-氯苯基）甲醇（克霉唑杂质Ⅰ）在ChP、USP、BP、EP和JP中均有具体限度的要求^[4]。

ChP 2015、USP 41-NF36、BP 2018、EP 8.0和JP 17.0中克霉唑有关物质项下的色谱条件和限度要求对比见表 1。各种方法系统适用性试验结果见图 1。

实验发现，咪唑在ChP 2015色谱条件下与溶剂峰重合；EP 8.0和BP 2018使用Spherical end-capped C8色谱柱，色谱峰在溶剂峰中间，且分离度不好；USP 41咪唑检测方法为TLC法，检测灵敏度低，克霉唑杂质Ⅰ检测方法为HPLC法，检测波长为254 nm；JP 17.0使用TLC方法检测，灵敏度低，无法准确定量。本文对以上药典方法进行优化，使克霉唑有关物质的检测定量更为准确。

1 仪器和试药

Waters UPLC高效液相色谱仪（Waters公司），配有紫外检测器、溶剂管理器、自动进样器；METER TOLEDO MX5百万分之一电子分析天平；密理博（Milli-Q）超纯水仪。

对照品克霉唑（批号100037-201407）、咪唑（批号100045-201304）、克霉唑杂质Ⅰ（批号100019-201304），中国食品药品检定研究院；乙腈（色谱纯，Fisher公司）；磷酸二氢钾和四丁基硫酸氢铵（分析纯，国药集团化学试剂公司）；水（超纯水）；克霉唑（市售，批号20140207）。

2 方法和结果 2.1 色谱条件

色谱柱：Reposil-pur Basic C₁₈（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相A为1.0 g磷酸二氢钾和0.5 g四丁基硫酸氢铵加水至1 000 mL，流动相B为乙腈，梯度洗脱（表 2）；检测波长：210 nm；流速：1.0 mL·min^-1；柱溫：25 ℃；进样体积：10 µL。

2.2 系统适用性试验

精密称取克霉唑1.982 mg、克霉唑杂质Ⅰ 2.133 mg和咪唑2.162 mg，置10 mL量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，作为系统适用性溶液，进样10 µL测定。见图 2。

2.3 供试品溶液

取克霉唑适量，精密称定，加乙腈溶解并稀释，摇匀，制成每1 mL含克霉唑0.2 mg的溶液。

2.4 检测下限和定量下限

取克霉唑对照品，精密称定4.712 mg，置25 mL量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，倍比稀释后进样，记录色谱图，计算。以信噪比3:1为检测下限，结果为0.019 ng；以信噪比10:1为定量下限，结果为0.064 ng。

2.5 精密度试验

取克霉唑对照品，精密称定4.712 mg，置25 mL量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图，计算峰面积的RSD（n=6）为0.12%，说明该方法精密度良好。

2.6 重复性试验

取供试品6份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，进样测定，记录色谱图，计算结果见表 3。

3 讨论 3.1 方法优势

采用Reposil-pur Basic C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，检测波长210 nm，流动相采用流动相梯度洗脱（见表 2），咪唑与溶剂峰可以完全分离，具有检测灵敏度高、重复性好等优点。

3.2 色谱柱的选择

通过各国药典比较，采用EP的流动相，使用常用的C18色谱柱，同时更换几种不同类型的C18色谱柱，发现咪唑峰与溶剂峰、其他杂质色谱峰均能分离。

3.3 波长的选择

克霉唑和咪唑的紫外最大吸收波长分别为209.1 nm和220 nm^[13]，本研究比对了210和215 nm波长处的检测结果，发现210 nm灵敏度高，基线平直，故采用210 nm进行检测。