2019, Vol. 39 
2. 四川大学华西药学院, 成都 610041
2. West China School of Pharmacy, Sichuan University, Chengdu 610041, China
复方氨酚苯海拉明片是由对乙酰氨基酚、咖啡因、盐酸麻黄碱和盐酸苯海拉明组成的复方制剂。临床用于感冒、发热、头痛，并伴有咳嗽症状者[1-3]。该品种现收载于《国家药品标准化学药品地方标准上升国家标准》第十二册，法定标准[4]中采用紫外-可见分光光度法测定对乙酰氨基酚和咖啡因的含量，但对其有关物质缺乏有效控制。为了保证药品质量和临床用药安全，有必要建立一个全面、准确、高效的分析方法[5-6]，对其有关物质进行测定。本研究结合4个主成分的原料合成工艺，已知杂质对照品（图 1）[7]和强力降解试验，建立了该复方制剂的有关物质检查方法，进行了方法学验证[8]，测定了7家企业产品的杂质量，对结果进行分析，为合理有效控制复方氨酚苯海拉明片的质量提供技术手段，并为其制剂的工艺优化和辅料选择提供参考依据。
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图 1 4个主成分的相关已知杂质 Fig.1 The structure of related substances in four main components |
Waters e2695/2487/2998高效液相色谱仪；METTLER CPA225D电子天平（精度0.01 mg/0.1 mg）；METTLER-SevenExcellence多参数测量酸度计。
对照品对乙酰氨基酚（批号100018-201610，含量99.9%）、咖啡因（批号171215-201512，含量99.9%）、盐酸麻黄碱（批号171241-201508，含量99.8%）、盐酸苯海拉明（批号100066－200807，含量99.9%）、对氨基酚（批号100802-201604，含量100%）、咖啡因杂质D（批号101110-201202，含量100%）、咖啡因杂质A（批号100121－201104，含量100%）、盐酸麻黄碱杂质B（盐酸伪麻黄碱）（批号171237-201510，含量99.8%）均来源于中国食品药品检定研究院，对照品咖啡因杂质F（批号2-AAH-100-1，含量99.14%）、对照品咖啡因杂质C（批号4-RVK-76-2，含量98%）、盐酸苯海拉明杂质C（批号2-GAB-138-1，95%）来源于TRC公司，对照品咖啡因杂质E（批号2257-005A8，含量100%）、盐酸苯海拉明杂质A（批号D-088，含量98%）、盐酸苯海拉明杂质B（批号1908-030A2，98.3%）来源于TLCstandards公司；对照品对乙酰氨基酚杂质B（批号F980188，含量95%）、对乙酰氨基酚杂质C（批号F539623，含量97%）、盐酸麻黄碱杂质A（批号F293049，含量95%）来源于一飞生物公司；对照品对乙酰氨基酚杂质D（批号LP70Q133，含量99%）来源于北京百灵威公司；对乙酰氨基酚杂质H对照品（批号GLLMF-OG，含量99.0%）来源于TCI公司；对乙酰氨基酚杂质F对照品（批号A14376.30，含量99%）来源于Alfa Aesar公司；对照品盐酸苯海拉明杂质D（批号50714，99.0%）、盐酸苯海拉明杂质E（批号106500，含量99.5%）来源于Dr.Ehrenstorfer GmbH。
7家企业生产的复方氨酚苯海拉明片，共2个规格，规格1为每片含对乙酰氨基酚300 mg、咖啡因30 mg、盐酸麻黄碱7.5 mg、盐酸苯海拉明7.5 mg，规格2为规格一中各主成分量的1/2。国内A、B、C、D、E、F、G企业生产的样品共44批。
乙腈为色谱纯，水为超纯水，磷酸为优级纯，磷酸二氢铵为分析纯。
2 方法与结果 2.1 色谱条件与系统适用性色谱柱为Waters XBridge C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相A为0.01 mol·L-1的磷酸二氢铵溶液（用磷酸调节pH至2.1±0.05），流动相B为乙腈，按表 1进行梯度洗脱，柱温为30 ℃，检测波长为205 nm，流速为1.0 mL·min-1，进样量为20 μL。
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表 1 流动相梯度洗脱程序 Tab.1 The gradient elution program of mobile phases |
取对照品盐酸苯海拉明杂质A和盐酸苯海拉明适量，加0.1%磷酸水溶液溶解并稀释制成每1 mL中约含盐酸苯海拉明杂质A 1 μg和盐酸苯海拉明250 μg的溶液，按上述色谱条件测定，苯海拉明杂质A与苯海拉明峰的分离度应大于1.0。
2.2 溶液的制备 2.2.1 对照品溶液精密称取4个主成分和各已知杂质对照品适量，加0.1%磷酸水溶液溶解并稀释制成每1 mL中约含各成分100 μg的溶液，作为各对照品储备液。精密量取对氨基酚和盐酸苯海拉明杂质A对照品储备液适量，加0.1%磷酸水溶液稀释制成每1 mL中约含对氨基苯酚10 μg和盐酸苯海拉明杂质A 1 μg的溶液，作为对照品溶液。精密量取上述各对照品储备液适量，加0.1%磷酸水溶液稀释制成每1 mL中约含对乙酰氨基酚100 μg·mL-1、咖啡因10 μg·mL-1、盐酸麻黄碱2.5 μg·mL-1、盐酸苯海拉明2.5 μg·mL-1、其他各已知杂质1 μg·mL-1的混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，见图 2。
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1.对氨基酚（4-aminophenol）2.咖啡因杂质E（caffeine impurity E）3.咖啡因杂质C（caffeine impurity C）4.咖啡因杂质D（caffeine impurity D）5.咖啡因杂质F（caffeine impurity F）6.咖啡因杂质A（caffeine impurity A）7.盐酸伪麻黄碱（盐酸麻黄碱杂质B）（ephedrine hydrochloride impurity B）8.对乙酰氨基酚杂质B（acetaminophen impurity B）9.对乙酰氨基酚杂质C（acetaminophen impurity C）10.对乙酰氨基酚杂质D（acetaminophen impurity D）11.对乙酰氨基酚杂质H（acetaminophen impurity H）12.麻黄碱杂质A（ephedrine impurity A）13.对乙酰氨基酚杂质F（acetaminophen impurity F）14.苯海拉明杂质A（diphenhydramine impurity A）15.苯海拉明杂质B（diphenhydramine impurity B）16.苯海拉明杂质C（diphenhydramine impurity C）17.盐酸苯海拉明杂质D（diphenhydramine hydrochloride impurity D）18.盐酸苯海拉明杂质E（diphenhydramine hydrochloride impurity E） 图 2 4个主成分和各已知杂质对照品混合溶液色谱图 Fig.2 The chromatogram of four main components and 18 known impurities |
精密称取本品细粉适量，加0.1%磷酸水溶液超声（频率40 kHz，功率150 W）使溶解并稀释制成每1 mL中约含对乙酰氨基酚10 mg的溶液，滤过，即得。
2.2.3 对照溶液精密量取“2.2.2”供试品溶液1 mL，置100 mL量瓶中，加0.1%磷酸水溶液稀释至刻度，摇匀，即得。
2.3 方法学验证 2.3.1 专属性采用酸（取粉末适量，加1 mol·L-1盐酸1 mL，水浴加热5 min，放冷，加1 mol·L-1氢氧化钠溶液1 mL，加0.1%磷酸水溶液溶解并稀释至10 mL）、碱（取粉末适量，加1 mol·L-1氢氧化钠溶液1 mL，水浴加热5 min，放冷，加1 mol·L-1盐酸1 mL，加0.1%磷酸水溶液溶解并稀释至10 mL）、氧化（取粉末适量，加30%过氧化氢溶液1 mL，于80 ℃放置2 h，取出，加0.1%磷酸水溶液溶解并稀释至10 mL）、高温（取粉末适量，于200 ℃放置1 h，加0.1%磷酸水溶液溶解并稀释至10 mL）及光照（取粉末适量，加0.1%磷酸水溶液溶解并稀释至10 mL后，置紫外光灯（254 nm）下放置2 d或日光灯4 500 lx下放置5 d）对4个主成分原料、片剂和辅料进行强力降解试验。结果在不同破坏条件下，各降解产物峰均能与主峰完全分离，空白辅料峰无干扰，表明该方法专属性良好（图 3）。
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1.空白溶剂（reagent）2.空白辅料溶液（excipients）3.片剂供试品溶液（test solution of tablet）4.光UV破坏溶液（UV-lightdestroyed solution）5.日光破坏溶液（lightdestroyed solution）6.碱破坏溶液（alkalidestroyed solution）7.热破坏溶液（high temperaturedestroyed solution）8.酸破坏溶液（aciddestroyed solution）9.氧化破坏溶液（oxidation destroyed solution） 图 3 专属性试验HPLC色谱图 Fig.3 The HPLC chromatograms for specificity |
取“2.2.1”项下对照品储备液，分别精密量取适量，加0.1%磷酸水溶液稀释制成不同浓度线性溶液。以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，求得回归方程，并以标准曲线法[9]计算18个杂质相对于各对应主峰的相对校正因子（f），结果见表 2。
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表 2 4个主成分及已知杂质线性范围与校正因子 Tab.2 Linear ranges and relative response factors of the known impurities and four main components |
取中间浓度线性溶液，连续进样6次，测得4个主成分及各杂质峰面积RSD（n=6）均小于1.2%，保留时间RSD（n=6）均小于1.0%，表明该方法精密度良好。
2.3.4 重复性取供试品溶液6份，进样。测得对氨基酚含量分别为对乙酰氨基酚标示量的0.023 4%、0.025 6%、0.026 9%、0.027 4%、0.028 4%、0.029 9%（RSD=0.23%），保留时间为3.001、3.005、3.006、3.003、3.002、3.005 min（RSD=0.20%）；盐酸苯海拉明杂质A分别为盐酸苯海拉明标示量的0.654%、0.669%、0.653%、0.643%、0.665%、0.693%（RSD=1.8%），保留时间为35.096、35.174、35.145、35.161、35.139、35.131 min（RSD=2.7%）；各未知杂质含量RSD均小于2.0%，保留时间RSD均小于3.0%。表明该方法重复性良好。
2.3.5 检测下限取“2.2.1”项下对照品溶液，逐级稀释至S/N约3~5，计算各杂质对照品的检测下限。结果对氨基酚、咖啡因杂质E、咖啡因杂质C、咖啡因杂质D、咖啡因杂质F、咖啡因杂质A、盐酸伪麻黄碱（盐酸麻黄碱杂质B）、对乙酰氨基酚杂质B、对乙酰氨基酚杂质C、对乙酰氨基酚杂质D、对乙酰氨基酚杂质H、盐酸麻黄碱杂质A、对乙酰氨基酚杂质F、盐酸苯海拉明杂质A、盐酸苯海拉明杂质B、盐酸苯海拉明杂质C、盐酸苯海拉明杂质D、盐酸苯海拉明杂质E的检测下限分别为1.06、2.14、0.51、0.42、0.41、0.54、1.03、0.68、0.51、0.57、0.69、1.06、1.10、0.58、0.71、1.02、0.40、0.56 ng。
2.3.6 稳定性取供试品溶液，分别于0、3、6、9、12、15、20、24 h进样，测得各杂质含量的RSD均小于2.0%，保留时间的RSD（n=6）均小于3.0%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
2.3.7 回收率分别精密量取“2.2.1”项下对照品储备液适量，置已称有空白辅料约0.05 g的10 mL量瓶中，限度浓度制备6份，按外标法分别计算回收率，18个杂质的平均回收率为98.3%~101.6%，RSD < 2%。结果见表 3。
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表 3 回收率结果（%，n=6） Tab.3 Results of recovery tests |
取7家企业的复方氨酚苯海拉明片，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，照“2.1”项下色谱条件进行有关物质检查，记录色谱图（见图 4）。已知杂质对氨基酚和盐酸苯海拉明杂质A按外标法计算，其他已知杂质按加校正因子的主成分自身对照法计算，未知杂质按不加校正因子的自身对照法计算[10]。结果显示，制剂中均未检出盐酸麻黄碱相关杂质；对乙酰氨基酚相关杂质主要有对氨基酚、对乙酰氨基酚杂质B、未知杂质Ⅰ和未知杂质Ⅱ，其中F企业样品中对氨基酚杂质量略高于其他6个生产企业，但均低于0.05%，7个生产企业样品中对乙酰氨基酚相关其余杂质量分布基本一致，均低于0.05%；咖啡因相关杂质主要有咖啡因杂质F和咖啡因杂质A，各生产企业杂质量分布基本一致，杂质检出量均低于0.05%；盐酸苯海拉明相关杂质主要有盐酸苯海拉明杂质A、盐酸苯海拉明杂质B、盐酸苯海拉明杂质D、未知杂质Ⅲ和未知杂质Ⅳ，盐酸苯海拉明杂质A检出量最高，44批次样品中除G企业两批次检出量高于5.0%以外，其余样品该杂质检出量在0.02%~0.80%之间，其余杂质量分布基本一致，均低于0.15%；除G企业两批次样品总杂质量高于5.0%以外，其余样品总杂质量在0.19%~1.04%之间。
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图 4 各企业（A~G）样品有关物质检查典型色谱图 Fig.4 Typical HPLC chromatograms of related substances in compound paracetamol and diphenhydramine hydrochloride tablets from different manufactures(A~G) |
4个主药成分对乙酰氨基酚为有机酸，咖啡因为生物碱，盐酸麻黄碱和盐酸苯海拉明为强酸弱碱盐，大部分企业辅料使用了碱性辅料羧甲基淀粉钠和硬脂酸镁。为研究原辅料相容性[11]，试验考察了在高温（60 ℃）、高湿（RH90%，25 ℃）和强光（4 500 lx）条件的影响因素下，各主药成分与碱性辅料配伍后杂质的变化趋势。
研究发现，4个主成分加硬脂酸镁，等量混合，在高温、高湿、强光下放置0、5、10 d后，各杂质量均无明显增加趋势；4个主成分加羧甲基淀粉钠等量混合，在高温、高湿、强光下放置0、5、10 d后，盐酸苯海拉明杂质A的量有明显增加趋势，分别从0 d的0.36%增加到10.2%、11.1%、28.8%，提示4种原料药和辅料羧甲基淀粉钠混合后对高温、高湿、强光均不稳定，存在配伍禁忌。
3 讨论 3.1 梯度-HPLC测定方法的建立本品为复方制剂，含4个主成分，杂质种类多，本研究建立了一种简单、高效、快速的梯度洗脱的色谱方法进行了有关物质检查，结果柱温为28~32 ℃、流速为0.9~1.0 mL·min-1时，杂质峰与其他成分峰能达到基本分离，色谱行为良好。考虑到盐酸苯海拉明与盐酸苯海拉明杂质A较难分离，HPLC方法须进行系统适用性试验且分离度应达到要求。
3.2 杂质归属和杂质限度通过保留时间对已知杂质进行确认；通过对各原料有关物质检查结果、原料强力降解试验、杂质PDA提取光谱图分析母核结构，对未知杂质进行归属。强力降解试验中发现盐酸麻黄碱很稳定，原料和制剂中均未检出相关杂质；对乙酰氨基酚和咖啡因的杂质主要来源于原料，盐酸苯海拉明在制剂工艺过程中会产生降解杂质，因此企业除应加强对购入原料的质量控制外，还应控制制剂合成工艺中的各个参数。对对应原辅料和生产的制剂进行有关物质检查结果发现，制剂中的大部分杂质来源于原料中的杂质，制剂生产工艺过程或贮藏过程中降解产生的杂质有对氨基酚、盐酸苯海拉明杂质A和盐酸苯海拉明杂质D。制剂中对乙酰氨基酚处方量最大，杂质量和杂质个数最多。杂质最终归属方法为保留时间在对乙酰氨基酚和盐酸麻黄碱色谱峰之间的杂质峰归属于咖啡因，保留时间在盐酸苯海拉明杂质A之后的杂质峰归属于盐酸苯海拉明，其他杂质峰归属于对乙酰氨基酚。
该品种在国内外药典中均未收载，处方中4个主成分原料在《中华人民共和国药典》2015年版第二部、USP 41-NF 36、EP 9、BP 2018和JP 17中均有收载。由于制剂中的杂质多来源于对乙酰氨基酚和盐酸苯海拉明这2个主药成分，参考《中华人民共和国药典》2015年版第二部中对乙酰氨基酚片和盐酸苯海拉明片质量标准[12]中有关物质项下的限度，结合样品测定结果，杂质限度暂定为对氨基酚和盐酸苯海拉明杂质A分别不得过对乙酰氨基酚标示量的0.1%和盐酸苯海拉明标示量的1.0%，其他单个杂质不得过1.0%，总杂质不得过2.0%。
3.3 原辅料相容性产物——盐酸苯海拉明杂质A本品中4个主成分有酸碱性，碱性辅料羧甲基淀粉钠与盐酸苯海拉明不相容，推测在碱性条件下盐酸苯海拉明结构中的甲基自由基发生了转移，生成了盐酸苯海拉明杂质A，见图 5。ADMET Predictor软件进行化合物毒性预测的结果表明，该杂质有较为严重的肝脏毒性，产生不良反应的可能性较大。提示企业在选择辅料时，应避免使用上述辅料。
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图 5 盐酸苯海拉明（A）降解产生盐酸苯海拉明杂质A（B）的过程 Fig.5 The degradation process of diphenhydramine hydrochloride(A) to diphenhydramine impurity A(B) |
从检测结果来看，国内多数企业复方氨酚苯海拉明片杂质控制良好，除G企业2批样品外，其余批次样品各杂质总和不大于2.0%。经统计发现，使用辅料羧甲基淀粉钠的C、D、F、G企业样品中所检出盐酸苯海拉明杂质A的量的平均值比A、B、E企业样品中的该杂质量高出近10倍（C企业：0.27%、D企业：0.11%、F企业：0.54%、G企业：0.56%；A企业：0.031%、B企业：0.024%、E企业：0.034%），其中G企业抽检到2批次样品中该杂质量为5.51%和5.61%，远远高于拟定标准中限度值1.0%，其余杂质量分布基本一致，均检出较低。提示企业应关注辅料的选择，关注生产工艺过程或贮藏过程中杂质量的变化，提高生产工艺稳定性和可控性。
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