心可宁胶囊处方由丹参、三七、红花、蟾酥、水牛角浓缩粉、牛黄、人参须、冰片八味中药组成，其中丹参水煮提取，其余三七、红花等七味均为生粉入药，具有活血散瘀、开窍止痛功能，用于冠心病、心绞痛、胸闷等症^[1-3]。据文献报道，近年来红花药材存在用酸性红73等染色现象^[4-7]，致使红花原药材中非法添加的酸性红73等色素被带入到成药中，给患者带来安全隐患。酸性红73又名酸性大红GR，为黄光红色粉末，溶于水呈红色溶液，能溶于酒精和溶纤素，在工业上主要用于羊毛、丝织物及纸张、皮革的染色，还可用于塑料、电化铝、水泥的着色^[8-10]。

目前心可宁胶囊中酸性红73检测方法未见报道，与中药材及其饮片相比，中成药多为复方制剂，其中可能存在酸性红73的含量较低，其他药味干扰较大，因此，有必要针对心可宁胶囊中的酸性红73检测方法进行系统研究，以更好地控制药品质量，保障人民用药安全。本文采用HPLC-DAD法对处方中含有红花、丹参等可能使用酸性红73染色的中成药进行筛查，并采用HPLC-MS/MS法对阳性结果进行确认。对收集的213批样品进行检查研究，其中24批检测出酸性红73，在此基础上本文还建立了阳性样品中酸性红73的HPLC含量检测方法，为打击中成药中非法染色提供了技术手段。

1 仪器与试药

DIONEX Ultimate 3000-TSQ ENDURA液质联用色谱仪（赛默飞世尔科技公司）；Waters 2695液相色谱仪；2998二级管阵列检测器（沃特世科技有限公司），METTLER AE240型电子天平（梅特勒-托利多，万分之一）；XSE205DU型电子天平（梅特勒-托利多，十万分之一）；超声波清洗仪KQ500DE（500 W，40 kHz）。酸性红73对照品（批号：111773-201602）由中国食品药品检定研究院提供，乙腈为色谱纯（Fisher Chemical公司），乙酸铵（国药集团化学试剂有限公司）等其他试剂均为分析纯。样品来源为国家食品药品监督管理总局心可宁胶囊品种抽验工作抽验样品及企业提供的部分样品。

2 方法与结果 2.1 HPLC筛查 2.1.1 对照品溶液的制备

取酸性红73对照品适量，精密称定，加70%甲醇制成每1 mL中含20 μg的溶液，用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.1.2 供试品溶液制备

取胶囊内容物约4 g，置具塞锥形瓶中，加入70%甲醇20 mL，密塞，超声处理（功500 W，40 kHz）20 min，放冷，摇匀滤过，取续滤液，即得。

未检出酸性红73的样品照本项下方法制备，即得阴性样品溶液。

2.1.3 色谱条件与系统适用性试验

采用Hypersil BDS C₁₈色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温：35 ℃；流动相：乙腈-0.05 mol·L^-1醋酸铵溶液（24:76）；DAD检测器，流速：0.8 mL·min^-1；检测波长：509 nm。理论塔板数按酸性红73峰计算应不低于3 000。

取”2.1”项下方法制备的心可宁胶囊阴性样品溶液、酸性红73对照品溶液和心可宁胶囊阳性样品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。结果见图 1。

2.1.4 专属性试验 2.1.4.1 HPLC-DAD法

取“2.1.2”项下心可宁胶囊阳性样品溶液与“2.2.1”项下酸性红73对照品溶液进行HPLC-DAD法检测，采用二极管阵列检测器比较相应色谱峰在200~600 nm波长范围的紫外-可见吸收光谱，其DAD检测紫外-可见吸收光谱图基本一致（见图 2）。

2.1.4.2 HPLC-MS/MS法

色谱柱：Shim-pack GIST C₁₈（2.1×100 mm，2 μm）；柱温：30 ℃；流动相：乙腈（A）-10 mmol·L^-1乙酸铵（B）溶液梯度洗脱（0~1.2 min，20%A；1.2~8 min，20%→90%A）；流速0.2 mL·min^-1。质谱采集参数：电喷雾负离子扫描（ESI-），毛细管电压2.0 kV，鞘气流速20 L·min^-1，辅助气流速8 L·min^-1，脱溶剂温度350 ℃，离子传输管温度350 ℃，采用多反应监测（MRM），选择质荷比m/z 255.0→150.5和m/z 255.0→241.0为检测离子对，碰撞能量为10.25 V。二级质谱图见图 3。

2.1.5 筛查结果

在本次筛查的213批次样品中，共有24批心可宁胶囊样品检出与酸性红73对照色谱保留时间相同的色谱峰，且该峰在200~600 nm波长范围的UV-Vis吸收光谱与对照品一致。主要涉及2家企业生产的样品，其中1家企业抽样80批，有18批检出酸性红73，检出率为22.5%，含量范围为6.25~10.99 μg·g^-1；另1家企业抽样7批，有6批检出酸性红73，检出率为85.7%，含量范围为78.99~87.6 μg·g^-1。

2.1.6 阳性样品确认

24批阳性样品均采用HPLC-MS/MS进行确认，出现与酸性红73对照色谱保留时间相同的色谱峰，且相应的提取离子流色谱图与对照品一致。

2.2 HPLC含量测定 2.2.1 对照品溶液的制备

精密称取酸性红73对照品12.03 mg，置100 mL量瓶中，加70%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液①（120.3 μg·mL^-1）；精密量取对照品溶液①5、1 mL，分别置25、100 mL量瓶中，加70%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液②（24.06 μg·mL^-1）、③（1.203 μg·mL^-1）。

2.2.2 供试品溶液的制备

取本品内容物约4 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇20 mL，密塞，称定，超声处理（500 W，40 kHz）20 min，放冷，称定，用70%甲醇补足减失的量，摇匀，滤过，即得。

2.2.3 色谱条件

同“2.1.3”项。

2.2.4 线性关系考察

精密吸取对照品溶液③（1.203 μg·mL^-1）1、5 μL，对照品溶液②（24.06 μg·mL^-1）5、10、15 μL，对照品溶液①（120.3 μg·mL^-1）5、10 μL注入液相色谱仪，测定，以峰面积积分值Y为纵坐标，进样量（X，μg）为横坐标，绘制标准曲线，得其回归方程：

Y=3.000×10⁶X-9.056×10³  r²=0.999 9

结果表明，酸性红73对照品进样量在0.001 203~1.203 μg范围内线性关系良好。

2.2.5 精密度试验

精密吸取对照品溶液②（24.06 μg·mL^-1），连续进样6次，每次10 μL，分别记录峰面积，计算RSD为0.56%，表明仪器精密度良好。

2.2.6 重复性试验

取心可宁胶囊（批号6E01），分别按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液各6份，进样10 μL进行分析，心可宁胶囊中酸性红73含量平均值为74.13μg·g^-1，RSD为1.1%。表明该法重复性良好。

2.2.7 稳定性试验

取“2.2.6”项下心可宁胶囊同一份供试品溶液，室温下放置，在0、6、12、18、24 h分别进样10 μL进行分析，分别记录峰面积，计算RSD为1.1%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.2.8 加样回收率试验

取已测定含量的样品（批号6E01，含酸性红73 74.13 μg·g^-1）2 g，共6份，分别精密称定，置已精密加入对照品溶液①（120.3 μg·mL^-1）1 mL蒸干后的具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇20 mL，密塞，称定量，超声处理20 min，放冷，称定，用70%甲醇补足减失的量，摇匀，滤过，即得。在上述液相色谱条件下进样分析，按外标法计算加样回收率，6批样品平均回收率为103.0%，RSD为0.96%。表明该法加样回收率较好。

2.2.9 检测下限和定量下限

取“2.2.1”项下酸性红73对照品溶液，用70%甲醇进行逐步稀释，以信噪比3:1的浓度作为仪器检测下限，信噪比10:1的浓度为仪器定量下限，测定其检测下限和定量下限分别为1.48 ng和7.29 ng。

2.2.10 样品测定

取心可宁胶囊阳性样品，照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，进样10 μL进行测定，用外标法计算含量，结果24批阳性样品中酸性红73含量最高为87.6 μg·g^-1，最低为6.25 μg·g^-1。

3 讨论

本文参考文献[11-12]，采用超声提取对样品进行了测定。文献报道的酸性红73等色素的HPLC条件主要有乙腈-磷酸缓冲盐溶液^[13-14]和乙腈-醋酸铵溶液^{[11, 15-16]}等。考虑到目前建立的方法同时使用HPLC法对酸性红73色素进行筛查和含量测定，采用HPLC-MS/MS对阳性样品进行确认，本文最终选择了乙腈-醋酸铵溶液系统。

与高效液相色谱法相比，TLC法具有简便快速等优点，本实验对采用TLC法对心可宁胶囊中酸性红73筛查也进行了考察。结果表明，供试品溶液较粘稠，酸性红73含量低的样品斑点不可见，加大点样量后，斑点拖尾严重，容易产生误判；尝试过柱处理和更换展开系统及提取溶剂，结果均不理想。薄层色谱法中酸性红73的检测下限约为40 ng，与HPLC法检出限1.48 ng相差较大。同时由于心可宁胶囊为复方制剂，其他药味的存在降低了可能存在的化工染料的浓度，也给测定带来很大的干扰。因此心可宁胶囊中酸性红73色素的测定还是以HPLC法为首选方法。采用建立的方法对213批心可宁胶囊样品进行了筛查，该方法快速简便，可用于心可宁胶囊中酸性红73的检测。实验结果表明，213批次样品中共筛查出24批阳性样品，中成药中存在化工染料染色的情况依然严峻，所以对中药材及饮片的非法染色情况应引起高度重视，加强监管力度。