柴胡桂枝汤出自《伤寒论》，为张仲景创立的经典方剂，由小柴胡汤和桂枝汤加减而来，全方由柴胡、半夏、人参、甘草、黄芩、生姜、大枣、桂枝、芍药9味药组成，既能调理营卫气血，又能和解表里，疏肝利胆，达到扶正祛邪之目的^[1-2]，用于太阳少阳合病引起的发热恶寒、肢体疼痛等症。中药色谱指纹图谱是一种综合的、可量化的鉴别手段，是当前符合中药特色的评价中药真实性、稳定性和一致性的质量控制模式之一^[3-4]。目前关于小柴胡汤及桂枝汤指纹图谱相关研究已有不少文献报道^[5-8]，但未见柴胡桂枝汤液相色谱指纹图谱的研究报道。为提高柴胡桂枝汤的质量控制水平，分析柴胡桂枝汤的化学成分轮廓，本研究采用高效液相色谱建立柴胡桂枝汤的指纹图谱分析方法，并通过对照品比对结合高分辨质谱对主要共有峰进行指认，为研究柴胡桂枝汤的药效物质基础及质量控制提供科学依据。

1 仪器与材料

岛津公司LC-IT-TOF-MS液相色谱串联离子阱飞行时间质谱仪，配置自动进样器、柱温箱、UV检测器；LC-MS solution工作站；岛津公司Inertsil ODS-SP C₁₈色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；Eppendorf 5424 R小型冷冻高速离心机离心机；0.22 μm微孔滤膜，津腾公司；天津市泰斯特仪器有限公司98-Ⅰ-B电子调温电热套；赛多利斯科学仪器（北京）有限公司BSA224S-CW电子天平；昆山市超声仪器有限公司KQ3200E型超声波清洗器。

超纯水由Milli-Q超纯水机（Millipore公司）制备；甲酸、甲醇为色谱纯，Fisher Scientific公司；对照品人参皂苷Re（批号110703-201731，含量以93.6%计）及甘草苷（批号111610-201607，含量以93.1%计）购于中国食品药品检定研究院；姜黄素、汉黄芩素、黄芩苷、芍药苷均购于成都普菲德生物技术有限公司，批号依次为160723、170512、171020、160918，质量分数均大于98%。实验所用药材购于盛实百草药业有限公司和北京友谊医院中药房，具体来源及批号见表 1。经北京友谊医院赵奎君教授鉴定，桂枝为樟科植物肉桂Cirmarnomum cassia Presl的干燥嫩枝；甘草为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥根和根茎的炮制品；黄芩为唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根；柴胡为伞形科植物柴胡Bupleurumchinense DC.的干燥根；大枣为鼠李科植物枣Ziziphus jujuba Mill.的干燥成熟果实；半夏为天南星科植物半夏Pinellia ternata（Thunb.）Breit.的干燥块茎；白芍为毛莨科植物芍药Paeonia lactiflora Pall.的干燥根；人参为五加科植物人参Panax ginseng C.A.Mey.的干燥根和根茎；生姜为姜科植物姜Zingiber officinale Rosc.的新鲜根茎，购于山东莱芜。

2 方法与结果 2.1 色谱条件

采用Inertsil ODS-SP C₁₈色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），以0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸甲醇溶液（B）为流动相，梯度洗脱（0~3 min，30%B；3~18 min，30%B→40%B；18~30 min，40%B→50%B；30~57 min，50%B→75%B；57~65 min，75%B→85%B；65~70 min，85%B→95%B；70~75 min，95%B；75~85 min，95%B→30%B）^[9]，流速0.6 mL·min^-1，检测波长275 nm，柱温25 ℃，进样量5 μL。

2.2 质谱条件

采用电喷雾化离子源，离子源温度为120 ℃，毛细管电压3 200 V，质量扫描范围m/z 100~1 000，干燥气体积流量10 L·min^-1，干燥气温度300 ℃。

2.3 供试品溶液的制备

准确称取桂枝、黄芩、人参、芍药、生姜各9 g，甘草6 g，半夏12 g，柴胡24 g，大枣25 g，8倍量水充分润湿，放置浸泡30 min，加热煮沸后回流提取1 h，趁热3层纱布过滤，滤渣加6倍量水回流提取30 min，滤过，合并滤液，浓缩至100 mL，得生药浓度为1.12 g·mL^-1柴胡桂枝汤药液，冷藏备用。

取柴胡桂枝汤药液，加超纯水稀释至0.14 g·mL^-1，涡旋1 min，12 000 r·min^-1高速离心10 min，取其上清液过0.22 μm的微孔滤膜，即得供试品溶液。

将处方中除生姜外的8种药材按不同产地进行排列组合，投药制备得到12批柴胡桂枝汤复方^[10]，具体药材来源组成见表 2。取12批柴胡桂枝汤复方，按上述方法制备供试品溶液（S1~S12）。

2.4 混合对照品溶液的制备

取各对照品适量，精密称定，加甲醇配制成混合对照品溶液（甘草苷80 μg·mL^-1，黄芩苷85 μg·mL^-1，汉黄芩素90 μg·mL^-1，人参皂苷Re 180 μg·mL^-1，姜黄素75 μg·mL^-1，芍药苷165 μg·mL^-1），过0.22 μm微孔滤膜，冷藏备用。

2.5 方法学考察 2.5.1 精密度试验

取供试品溶液S3，按“2.1”项下条件连续进样6次进行测定，其相似度不小于0.999；以14号峰作参比，各主要色谱峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD均小于5%（见表 3），表明该方法精密度良好。

2.5.2 重复性试验

按“2.3”项下方法平行制备S3供试品溶液6份，按“2.1”项下条件进样测定，其相似度不小于0.998；以14号峰作参比，各主要色谱峰相对保留时间及相对峰面积的RSD均小于5%（见表 3），表明本方法重复性良好。

2.5.3 稳定性试验

取供试品溶液S3，分别在0、2、4、6、12、24 h按“2.1”项下条件进样测定，记录色谱图，其相似度不小于0.999；以14号峰作参比，各主要色谱峰相对保留时间及相对峰面积的RSD均小于5%（见表 3），表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.6 样品测定 2.6.1 指纹图谱的建立及相似度分析

取混合对照品溶液，按照“2.1”项下的条件进行测定，记录色谱图（图 1）。取12批柴胡桂枝汤复方的供试品溶液（S1~S12），按照“2.1”项下的条件进行测定，记录色谱图（图 2）。按照《中药色谱指纹图谱》要求，将12批柴胡桂枝汤供试品溶液的图谱导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版）》进行分析，将峰面积较大、分离度较好的色谱峰进行标定，共标定21个共有峰（图 2），以中位数法建立对照指纹图谱（R），计算12批提取物与对照图谱之间的相似度，结果见表 4，表明不同批次的柴胡桂枝汤之间相似度良好，质量稳定。通过对照品比对，确定芍药苷、甘草苷、黄芩素、人参皂苷Re、汉黄芩素、姜黄素6个共有峰。

2.6.2 质谱成分指认

通过质谱并结合参考文献的方法^[11-14]指认出12批柴胡桂枝汤样品中8个成分，其中4号峰为根皮酚，11号峰为黄芩黄素，12号为5，7-二羟基黄酮，13号峰为8-甲氧基黄酮-5-O-葡糖苷，14号峰为牡丹酚原苷，16号峰为表儿茶素，18号峰为人参皂苷Rg1，21号峰为柴胡皂苷A，见表 5。

3 讨论

本实验考察对比了不同的流动相系统，包括乙腈-水、0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水溶液、甲醇-水、0.1%甲酸甲醇-0.1%甲酸水溶液；结果表明，以0.1%甲酸甲醇-0.1%甲酸水溶液体系为流动相，采用梯度洗脱，能够达到较好的洗脱效果，各色谱峰的峰形和分离度相对较好，故选用0.1%甲酸甲醇-0.1%甲酸水溶液作为流动相系统。柱温考察15、20、25、30、40 ℃，柱温度降低分离度增加，但保留时间也相应延长，综合考虑选择25 ℃作为分离柱温。流动相流速考察0.4、0.6、0.8 mL·min^-1。0.8 mL·min^-1色谱峰分离度降低，个别色谱峰发生合并；0.4 mL·min^-1各色谱峰保留时间增加，故选择0.6 mL·min^-1，分离度好，保留时间适中。

精密吸取柴胡桂枝汤供试品溶液5 μL，进样分析，利用DAD检测器进行紫外扫描检测，对254、275、280、320 nm 4个波长下检测的色谱图进行比较，确定合适的检测波长，结果表明供试品在275 nm检测波长下检出色谱峰信息较全，峰面积最大，且基线较为稳定，故选择275 nm作为检测波长。

本文建立了柴胡桂枝汤指纹图谱方法，并进行方法学考察, 显示该方法精密度和重复性良好。标定了21个共有峰，并通过对照品对比确认了芍药苷、甘草苷、黄芩素、人参皂苷Re、汉黄芩素、姜黄素6个共有峰，采用质谱分析及参考文献指认出根皮酚、黄芩黄素、5，7-二羟黄酮、8-甲氧基黄酮-5-O-葡糖苷、牡丹酚原苷、表儿茶素、人参皂苷Rg1、柴胡皂苷A 8个共有峰。计算得12批柴胡桂枝汤相似度大于0.99，结果表明不同批次的柴胡桂枝汤之间相似度良好，质量稳定。该方法可以为柴胡桂枝汤质量控制提供参考，对柴胡桂枝汤的临床应用意义重大。