2019, Vol. 39 
2. 新疆植物药资源与利用教育部重点实验室, 石河子 832000
2. Key Laboratory of Xinjiang Phytomedicine Resource and Utilization, Ministry of Education, Shihezi University, Shihezi 832000, China
茵栀黄颗粒收录于2015年版《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）第一部，由茵陈、栀子、黄芩、金银花4味药材的提取物制成[1]。传统中药理论认为该方中茵陈为君药，栀子、黄芩为臣药，佐以具有清热解毒作用的金银花，共同起到清热解毒及利湿退黄的功效[2-3]。经现代医学研究表明，茵栀黄颗粒具有保肝利胆及抗肝纤维化等作用[4]，该方中君药茵陈的提取物具利胆保肝，解热镇痛，消炎等作用[5]；臣药栀子的提取物具有镇痛抗炎，调节血糖，抗血栓，抗动脉粥样硬化等功效[6-7]；臣药黄芩的提取物具抗菌，抗炎，抗病毒，抗氧化等作用，并能有效改善肝、肺、心肌等器官纤维化病变[8-9]；佐药金银花的提取物具有解热抗炎，抗肿瘤，降血糖，降血脂，免疫调节等多种药效[10-11]。临床上将茵栀黄颗粒主要用于辅助治疗新生儿黄疸症，该制剂能有效保障新生儿的生命安全并降低由于胆红素代谢和排泄异常而引发的神经性脑病的发生率[12-13]。
目前，茵栀黄颗粒成分的定性定量研究已有部分文献报道[14-16]，如陈永刚等[14]应用高效液相色谱-波长切换法同时测定了茵栀黄颗粒中绿原酸、咖啡酸、栀子苷、黄芩苷等7个有效成分；范建伟等[15]应用HPLC建立了测定茵栀黄颗粒中栀子苷、山栀苷、去乙酰车叶草苷酸甲酯和京尼平-1-β-D-龙胆二糖苷4个环烯醚萜苷类成分含量的方法；彭明丽等[16]应用HPLC法同时测定了茵栀黄颗粒中黄芩苷、木犀草素和绿原酸的含量。以上方法的定性定量研究多涉及为茵栀黄颗粒中的部分成分，极少同时测定茵栀黄颗粒中十几种成分。因此，本实验建立了高效液相色谱法对茵栀黄颗粒进行成分分析，并测定了新绿原酸、绿原酸、京尼平苷、1，3-二咖啡酰奎宁酸、木犀草苷、3，4-二咖啡酰奎宁酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸、黄芩苷、滨蒿内酯、汉黄芩素、黄芩素、汉黄芩苷及千层纸素A共14个有效成分的含量，为完善茵栀黄颗粒质量评价标准提供实验依据。
1 仪器与试药二元高压双泵LC-20AT高效液相色谱仪（岛津公司）；SPD-M20A光电二极管阵列紫外可见光检测器（岛津公司）；KQ-500DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；ES 225SM-DR型十万分之一天平（SWISS MADE）；金怡旋涡混合器（金坛市医疗仪器厂）；SZ-93自动双重纯水蒸馏器（上海雅荣生化仪器设备有限公司）。
化学对照品新绿原酸（批号AF7050442）、京尼平苷（批号AF7110308）、1，3-二咖啡酰奎宁酸（批号AF8030809）、3，4-二咖啡酰奎宁酸（批号AF7080124）、4，5-二咖啡酰奎宁酸（批号AF7060542）、黄芩苷（批号AF7061702）、滨蒿内酯（批号AF8030807）、汉黄芩素（批号AF7121402）、黄芩素（批号AF8030808）、汉黄芩苷（批号AB7100922）、千层纸素A（批号AF7110209）均购自成都埃法生物科技有限公司，绿原酸（批号110753-200413）购自中国食品药品检定研究院，3，5-二咖啡酰奎宁酸（批号161022）购自成都昂赛思生物科技有限公司，木犀草苷（批号Y05D8H49919）购自上海源叶生物科技有限公司，其纯度均＞98.0%（HPLC测定）。市售1~8号茵栀黄颗粒样品，批号分别为09180011、08118030、08118020、00918004、00917188、00917122、00917102、00916101，鲁南厚普制药有限公司。甲酸为分析纯，天津市富宇精细化工有限公司；乙腈、甲醇为色谱纯，Fisher公司；水为超纯水。
2 方法与结果 2.1 色谱条件色谱柱：迪马公司Diamonsil C18（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0~5 min，15%A→20%A；5~20 min，20%A→35%A；20~40 min，35%A→55%A；40~45 min，55%A→35%A）；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：325 nm；柱温：30 ℃；进样量：20 μL；运行时间：45 min。
2.2 溶液制备 2.2.1 供试品溶液取茵栀黄颗粒适量，研细，取0.20 g，精密称定，置25 mL具塞锥形瓶中，加50%甲醇水约20 mL，超声提取（300 W，40 kHz）30 min。提取液取出放冷后用50%甲醇水定容至25 mL，摇匀，过滤，弃去初滤液，取续滤液过0.22 μm微孔滤膜，即得。
2.2.2 对照品溶液精密称取新绿原酸、绿原酸、京尼平苷、1，3-二咖啡酰奎宁酸、木犀草苷、3，4-二咖啡酰奎宁酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸、黄芩苷、滨蒿内酯、汉黄芩素、黄芩素、汉黄芩苷、千层纸素A的对照品适量，分别用甲醇溶解，制成质量浓度均为1.0 mg·mL-1的14个对照品储备液。分别取14个对照品储备液各0.1 mL，置同一5 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，混匀，即得混合对照品溶液。依次精密吸取新绿原酸、绿原酸、汉黄芩素的对照品储备液各1 mL，1，3-二咖啡酰奎宁酸、木犀草苷、黄芩素的对照品储备液各0.5 mL，3，4-二咖啡酰奎宁酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸的对照品储备液各1 mL，滨蒿内酯、汉黄芩苷、千层纸素A的对照品储备液各1 mL，分别置于4个10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，混匀，即得混合对照品溶液A、B、C、D。将上述对照品储备液、混合对照品溶液于4 ℃保存，备用。
2.3 方法学考察 2.3.1 系统适用性考察取混合对照品溶液和供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下测定，发现混合对照品及供试品中各化合物的色谱峰基本达到基线分离，并且分离度良好，见图 1。
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1.新绿原酸（neochlorogenic acid）2.绿原酸（chlorogenic acid）3.京尼平苷（geniposide）4.1，3-二咖啡酰奎宁酸（1，3-dicaffeoylquinic acid）5.木犀草苷（luteoloside）6.3，4-二咖啡酰奎宁酸（3，4-dicaffeoylquinic acid）7.3，5-二咖啡酰奎宁酸（3，5-dicaffeoylquinic acid）8.4，5-二咖啡酰奎宁酸（4，5-dicaffeoylquinic acid）9.黄芩苷（baicalin）10.滨蒿内酯（scoparone）11.汉黄芩素（wogonin）12.黄芩素（baicalein）13.汉黄芩苷（wogonoside）14.千层纸素A（oroxylin A） 图 1 样品（A）、混合对照品（B）色谱图 Fig.1 HPLC chromatograms of sample(A)and mixed reference substances(B) |
精密吸取黄芩苷对照品储备液0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL，分别用甲醇稀释并定容至1.0 mL，即得系列黄芩苷对照品溶液；精密吸取京尼平苷对照品储备液0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14 mL，分别用甲醇稀释并定容至1.0 mL，即得系列京尼平苷对照品溶液；精密吸取混合对照品溶液A 0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL，混合对照品溶液B 0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、3.0 mL，混合对照品溶液C 0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，混合对照品溶液D 0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 mL，分别用甲醇稀释并定容至10.0 mL，即得系列混合对照品溶液。在“2.1”项色谱条件下，取上述各浓度系列对照品溶液分别进样20 μL进行分析，以峰面积积分值Y对进样浓度X（μg·mL-1）进行回归，绘制标准曲线，计算14个成分的回归方程及线性范围，结果见表 1，表明进样浓度在一定范围内与峰面积呈良好的线性关系。
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表 1 14个成分的回归方程、相关系数、线性范围及检测下限、定量下限 Tab.1 The regression equations, correlation coefficients, linear ranges, LOD and LOQ of 14 components |
取混合对照品溶液适量，逐步稀释，按“2.1”项下条件进样20 μL进行测定，信噪比为3：1时测得检测下限，信噪比为10：1时测得定量下限，见表 1。
2.3.4 精密度试验精密吸取“2.3.2”项下各系列黄芩苷对照品溶液、京尼平苷对照品溶液、混合对照品溶液各20 μL，分别在“2.1”项色谱条件下连续进样6次，记录色谱图峰面积，分析计算得新绿原酸、绿原酸、京尼平苷、1，3-二咖啡酰奎宁酸、木犀草苷、3，4-二咖啡酰奎宁酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸、黄芩苷、滨蒿内酯、汉黄芩素、黄芩素、汉黄芩苷及千层纸素A峰面积的RSD（n=6）分别为2.0%、2.3%、1.1%、1.1%、2.0%、1.8%、1.8%、1.6%、2.4%、1.4%、1.3%、2.1%、0.83%和0.91%，表明仪器精密度良好。
2.3.5 稳定性试验精密吸取供试品溶液20 μL，分别于0、2、4、8、12、24 h进样分析，测得新绿原酸、绿原酸、京尼平苷、1，3-二咖啡酰奎宁酸、木犀草苷、3，4-二咖啡酰奎宁酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸、黄芩苷、滨蒿内酯、汉黄芩素、黄芩素、汉黄芩苷及千层纸素A峰面积的RSD（n=6）分别为2.2%、1.0%、1.6%、1.9%、2.3%、2.4%、0.67%、1.9%、2.2%、2.1%、1.1%、0.86%、2.5%、0.77%，表明供试品溶液中各待测成分在24 h内稳定性良好。
2.3.6 重复性试验取茵栀黄颗粒粉末，按“2.2.1”项下方法平行制备供试品溶液6份，在“2.1”项色谱条件下测定，测得新绿原酸、绿原酸、京尼平苷、1，3-二咖啡酰奎宁酸、木犀草苷、3，4-二咖啡酰奎宁酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸、黄芩苷、滨蒿内酯、汉黄芩素、黄芩素、汉黄芩苷及千层纸素A的平均含量分别为0.620、2.500、5.597、0.351、2.860、0.454、0.254、0.494、76.25、0.013、0.713、1.890、0.234、0.063 mg·g-1，RSD分别为2.0%、2.4%、1.2%、1.3%、1.9%、1.2%、0.68%、1.5%、1.9%、2.0%、1.1%、0.95%、1.9%、1.5%，表明该方法的重复性良好。
2.3.7 加样回收率试验精密称取9份已知含量的茵栀黄颗粒样品0.10 g，按各成分含量的80%、100%、120%分别加入14个成分的对照品储备液，按“ 2.2.1”项下方法制成供试溶液，在“2.1”项色谱条件下测定，计算各成分的加样回收率以及RSD，结果见表 2。
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表 2 茵栀黄颗粒加样回收率试验结果 Tab.2 Recovery results of Yinzhihuang granules |
取不同批次的样品各3份，分别按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下测定，以外标法计算含量，结果见表 3。
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表 3 不同批次茵栀黄颗粒中14个主要成分的含量（n=3） Tab.3 Contents of fourteen main components in Yinzhihuang granules of different batches |
在流动相的选择上，比较了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水溶液，以各色谱峰分离度、出峰时间、峰形为评价指标。以甲醇-水系为流动相梯度洗脱时，柱压较高，峰形较差；以乙腈-0.1%甲酸水溶液梯度洗脱时，柱压较低，各色谱峰分离良好且基线平稳，故选定乙腈-0.1%甲酸水溶液作为梯度洗脱流动相。
3.2 检测波长的选择根据《中国药典》2015年版及各成分的出峰时间，比较了供试品溶液在波长238、280、325 nm时的色谱图数据，结果表明在325 nm波长下，新绿原酸、绿原酸、1，3-二咖啡酰奎宁酸、木犀草苷、3，4-二咖啡酰奎宁酸、3，5-二咖啡酰奎宁酸、4，5-二咖啡酰奎宁酸、黄芩苷、滨蒿内酯、汉黄芩素、黄芩素、汉黄芩苷、千层纸素A均有较强的吸收，京尼平苷虽吸收较弱，但是在此波长下仍可以进行有效检测，且该波长下基线平稳，出峰数较多，色谱峰响应值较高，故最终选择325 nm为检测波长。
4 结论本实验建立了高效液相色谱法同时测定茵栀黄颗粒中14个有效成分的含量，且该方法操作简单，测定结果准确可靠，并具有较好的重复性、稳定性，可实际应用于对茵栀黄颗粒的含量测定，为完善茵栀黄颗粒质量评价标准提供了实验依据，同时为后续研究茵栀黄颗粒中有效活性成分提供实验基础。
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