2019, Vol. 39 
骨疏康胶囊和骨疏康颗粒含淫羊藿、熟地黄、骨碎补、黄芪、丹参、木耳、黄瓜子七味中药，具有补肾益气、活血壮骨的功效[1]，用于肾虚气血不足所致的中老年骨质疏松症，有报道称：骨疏康胶囊可改善糖皮质激素性骨质疏松症患者的骨密度和骨代谢[2]，温针联合骨疏康胶囊治疗膝关节骨性关节炎可有效改善患者的临床症状[3]。
《中华人民共和国药典》收载的骨疏康制剂中，淫羊藿苷的含量测定采用高效液相色谱法，黄芪甲苷、丹参酮ⅡA及柚皮苷均为鉴别项目，而熟地黄的有效成分毛蕊花糖苷、黄芪的有效成分毛蕊异黄酮葡萄糖苷未收载为该品种的质量控制项目。国内外文献报道中，对淫羊藿苷、黄芪甲苷、丹参酮ⅡA、柚皮苷、毛蕊花糖苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷的测定常见有液相色谱-质谱联用法[4-12]。而针对有关骨疏康制剂的测定仅限于利用高效液相法测定淫羊藿苷和柚皮苷的含量[13-14]，其余成分的含量测定暂未见报道。
本实验采用高效液相色谱-串联质谱法同时测定骨疏康制剂中6个成分的含量，为评价和控制骨疏康胶囊和骨疏康颗粒的质量提供科学依据。
1 仪器与试药 1.1 仪器高效液相色谱-串联质谱仪（ExionLC AC-Triple Quad 4500）（AB SCIEX公司），XTerra C18色谱柱（2.1 mm×150 mm，3.5 μm，Waters公司）；SHIMADZU AUW0 D型电子天平（十万分之一，岛津公司）；ULUP-Ⅳ-20 T超纯水机（优普公司）。
1.2 药品及试剂骨疏康颗粒（辽宁康辰药业有限公司，批号170318、171101、160304），骨疏康胶囊（辽宁康辰药业有限公司，批号171119、170912）；对照品淫羊藿苷（批号110737-201516）、毛蕊异黄酮葡萄糖苷（批号111920-201203）、丹参酮ⅡA（批号110766-200619）、柚皮苷（批号110722-201714）、黄芪甲苷（批号110781-200613）、毛蕊花糖苷（批号111530-201310）购于中国食品药品检定研究院；乙腈（批号JA0）和甲酸（批号167136）为色谱纯，其他试剂均为分析纯；实验用水均为超纯水。
2 方法与结果 2.1 液相色谱条件色谱柱为XTerra C18（2.1 mm×150 mm，3.5 μm）；流速为0.3 mL·min-1；流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱（0~2 min A为80%，20~25 min A为10%，35 min A为80%）；柱温为40 ℃；进样量为5 μL。
2.2 质谱条件电喷雾离子源（ESI），正负离子模式同时监测，正离子源电压为5.5 kV，负离子源电压为-4.5 kV，气帘气流量为262 Pa；碰撞气流量为62 Pa；接口温度为550 ℃；雾化器压力为275.8 Pa；辅助加热气流量为310 Pa。采用多反应监测（MRM）模式，待测物的母离子、子离子及化合物参数见表 1。
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表 1 质谱参数 Tab.1 MS parameters |
分别取淫羊藿苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、丹参酮ⅡA、柚皮苷、黄芪甲苷、毛蕊花糖苷的对照品10 mg，精密称定，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度；再用50%甲醇水制成含6个化合物浓度均约为0.8 μg·mL-1的对照品储备液，待用。
2.3.2 供试品溶液取样品粉末1 g，精密称定，置于100 mL量瓶中，加50%甲醇水60 mL，超声（功率500 W，频率60 kHz）20 min，室温放置，用50%甲醇水定容至刻度，混匀，滤过，精密量取续滤液2 mL，置25 mL量瓶中，加50%甲醇水定容至刻度，摇匀，用0.22 μm有机滤膜过滤，即得。
2.3.3 阴性样品溶液取不含6个待测成分的阴性样品，按“2.3.2”项下方法操作制得阴性样品溶液。
2.4 专属性试验取混合对照品、供试品溶液及阴性样品溶液各5 μL，在“2.1”及“2.2”项色谱质谱条件下进样测定。结果显示，供试品溶液与对照品溶液目标峰的保留时间一致，阴性样品色谱图中未见相应色谱峰，表明样品测定无干扰，分别选取各成分的定量离子对例举，见图 1。
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图 1 阴性样品（A）、对照品（B）及样品（C）选择离子流图 Fig.1 MRM chromatograms of negative sample(A), reference substance(B)and sample(C) |
利用仪器自动进样器，分别精密吸取对照品储备液适量，按上述色谱质谱条件测得峰面积，并以待测物质峰面积为纵坐标（Y），各物质浓度为横坐标（X，ng·mL-1），绘制标准曲线并进行线性回归计算，得相应的标准曲线回归方程，结果表明，各成分在相应的线性范围内线性关系良好。同时，以峰面积为3倍（S/N=3）和10倍（S/N=10）为检测下限和定量下限，结果见表 2。
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表 2 线性关系考察、检测下限及定量下限测定结果 Tab.2 Results of linear relation, LOD and LOQ |
精密吸取“2.3.1”项的混合对照品储液，连续进样6次，测定峰面积并计算其RSD。结果淫羊藿苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、丹参酮ⅡA、柚皮苷、黄芪甲苷、毛蕊花糖苷的RSD（n=6）分别为2.5%、2.8%、1.1%、4.3%、4.8%、1.1%，表明该仪器精密度良好。
2.7 稳定性试验取供试品溶液（批号171101），分别于0、2、4、8、12、24 h进样测定，记录峰面积。结果淫羊藿苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、丹参酮ⅡA、柚皮苷、黄芪甲苷、毛蕊花糖苷的RSD（n=6）分别为2.6%、4.2%、4.3%、5.6%、5.8%、2.8%，表明供试品溶液在24 h内稳定。
2.8 重复性试验取样品（批号171101）6份，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，进行测定，记录峰面积并计算样品含量。结果淫羊藿苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、丹参酮ⅡA、柚皮苷、黄芪甲苷、毛蕊花糖苷平均含量（n=6）分别为2.033、0.059 64、0.085 58、0.102 2、0.053 62、0.043 44 mg·g-1，RSD分别为1.1%、2.3%、4.4%、3.6%、5.6%、2.7%，表明该方法重复性良好。
2.9 加样回收率试验取样品（批号171101）约0.3 g，共6份，精密称定，分别加入混合对照品储备液适量，按“2.3.2”项下供试品溶液方法制备，进样测定，计算回收率，结果见表 3，表明本方法加样回收率良好。
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表 3 回收率试验结果（n=6） Tab.3 Results of recovery |
取颗粒剂及胶囊内参物各3批，每批取3份，研细，按“2.3.2”项方法制备供试品溶液，进行测定，代入线性回归方程，分别计算各成分的含量，结果见表 4。
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表 4 样品含量结果（mg·g-1，n=3） Tab.4 Content determination of samples |
比较不同溶剂水、50%甲醇水、甲醇的提取效果，结果显示，甲醇提取时，丹参酮ⅡA提取效果明显高于其他2种试剂，柚皮苷3种溶液提取效果差别不大，其余4个化合物均为50%甲醇水的提取效率更高，且当使用甲醇作为提取溶液时，在液相色谱质谱仪测定中，极易产生溶剂效应，综合考虑，选用50%甲醇水作为样品提取溶液。提取方法选用超声提取法，比较超声时间10、20、30 min，结果显示超声20 min后，各成分基本提取完全。
3.2 流动相的选择在色谱条件中分别考察了甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-0.2%甲酸水、乙腈-0.5%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸-5 mmol·L-1乙酸铵水溶液，当选用乙腈作为有机相时；各成分峰的峰宽均比选用甲醇作为有机相时更窄，且黄芪甲苷的响应明显增强，故选择乙腈作为有机相；比较水相中不同的酸浓度及加入一定量的盐，结果显示加入盐虽能改善各成分的分离度，但并未提高响应，酸浓度越高，毛蕊花糖苷响应随之降低，黄芪甲苷响应稍有提高，其余成分未有变化。综合考虑，选用乙腈-0.1%甲酸水作为流动相。
3.3 质谱条件的优化在质谱条件优化中分别考察了离子源电压、接口温度、雾化器压力、气帘气流量、碰撞气流量等参数对化合物测定的影响，结果确定的离子源参数为正离子源电压5.5 kV，负离子源电压-4.5 kV，气帘气流量262 Pa；碰撞气流量62 Pa；接口温度550 ℃；雾化器压力275.8 Pa；辅助加热气流量310 Pa。对各化合物测定离子对的参数优化中，正模式下，淫羊藿苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、丹参酮ⅡA、柚皮苷的[M+H]+离子峰均有较好的响应；负模式下，毛蕊花糖苷产生的[M-H]-的离子峰响应强，而黄芪甲苷在正模式下易产生[M+H]+和[M+Na]+ 2个离子峰，在负模式下易产生[M+HCOO]-离子峰，但[M+Na]+和[M+HCOO]-作为母离子所产生的子离子并不丰富，对于MRM监测模式并不适用，因此选择[M+H]+作为黄芪甲苷的监测离子，而[M+H]+产生的二级子离子有587.5、143.2，选取785.6→143.2作为定量离子对，与夏义平[15]的研究结果一致。
综上所述，本实验建立同时测定骨疏康颗粒及骨疏康胶囊中6个成分含量的方法，该方法快速、准确、高效、灵敏，为该药的质量控制提供了有效的检测手段。
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